神經(jīng)節(jié)苷脂GM1對(duì)阿爾茨海默病的作用機(jī)制

單位：北京醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 北京醫(yī)科大學(xué)精神衛(wèi)生研究所 

　　摘　要　目的：研究神經(jīng)節(jié)苷脂GM1對(duì)β淀粉樣蛋白（Aβ）分泌和β淀粉樣蛋白前體（APP）基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，探討GM1在阿爾茨海默病Aβ生成過(guò)程中的作用機(jī)制。方法：利用人類(lèi)APP695基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株，免疫沉淀Western印跡法檢測(cè)經(jīng)不同濃度GM1處理的細(xì)胞培養(yǎng)液中的Aβ含量，逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法測(cè)定細(xì)胞中APP mRNA水平。結(jié)果：隨GM1濃度增加，細(xì)胞分泌Aβ增加，GM110μmol．L-1組和100μmol．L-1組分別為對(duì)照組的1.33倍（t=1.29，P＞0.05）和3.07倍（t=3.63，P＜0.05）；而APP mRNA水平無(wú)變化，APP特異性片段與內(nèi)參照的比值3個(gè)組無(wú)顯著性差異（F=0.23，P＞0.05）。結(jié)論：GM1不影響APP基因轉(zhuǎn)錄水平，其促進(jìn)細(xì)胞分泌Aβ的作用可能與干擾APP的水解代謝有關(guān)。
   
　　阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）最主要的病理特征之一是老年斑（senile plaques，SP）形成。β-淀粉樣蛋白（amyloid-β　protein，βA4或Aβ）是SP的核心成份。AD病人腦中SP的數(shù)量與癡呆的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。因此，對(duì)于有關(guān)影響Aβ的生成、降解、聚集等因素的研究成為現(xiàn)今AD研究的熱點(diǎn)之一。Aβ是它的前體蛋白——β-淀粉樣蛋白前體（amyloid β-protein precursor，APP）的代謝產(chǎn)物，因而，影響APP表達(dá)及代謝的因素勢(shì)必在Aβ生成過(guò)程中起重要作用。
 
　　神經(jīng)節(jié)苷脂（gangliosides）GM1是中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞膜的重要組成部分。對(duì)于GM1與AD的關(guān)系，目前研究存在爭(zhēng)議。一方面，GM1具有促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的作用，對(duì)損傷后的神經(jīng)組織有營(yíng)養(yǎng)和修復(fù)等功能，臨床上應(yīng)用GM1治療周?chē)?a title=神經(jīng)損傷吃什么藥 href=http://www.358cha.cn/nervous/neuro_injury/ >神經(jīng)損傷、脊髓損傷和中風(fēng)等，甚至有學(xué)者將其試用于AD的治療。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)，AD病人血中檢出顯著GM1抗體，AD病人腦組織中的質(zhì)膜Aβ可與GM1緊密結(jié)合，膜結(jié)合型的GM1可以促進(jìn)Aβ的纖維化，說(shuō)明GM1有可能參與AD的發(fā)病機(jī)制。近期研究發(fā)現(xiàn)，外源性給予GM1可使人類(lèi)APP695基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌Aβ增加，細(xì)胞中APP含量增加。本研究即是在此基礎(chǔ)上，利用APP695基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型，探討GM1增加Aβ生成的作用是否與促進(jìn)APP基因表達(dá)有關(guān)。
 
　　1　材料與方法
　　1．1　細(xì)胞模型與培養(yǎng)
　　人類(lèi)APP695 cDNA轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（HY-SY5Y，德國(guó)海德堡大學(xué)分子生物學(xué)中心提供）。將細(xì)胞等分于3個(gè)50 ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，每瓶加10 ml 培養(yǎng)基 （MEM及 F-12各半，加體積分?jǐn)?shù)為10%的滅活胎牛血清，潮霉素B0．4mg．L-1，購(gòu)于Gibco和BM公司），于37℃，5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2條件下培養(yǎng)，至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)密度大于95%。棄培養(yǎng)液，用1×PBS（pH 7．5）洗滌，分別加入不含血清培養(yǎng)基3ml，兩實(shí)驗(yàn)組分別加入10和100μmol．L-1GM1，對(duì)照組細(xì)胞加入等體積PBS（pH 7．5）。細(xì)胞于37℃，5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2條件下培養(yǎng)8h。
 
　　1．2　免疫沉淀及Western印跡檢測(cè)培養(yǎng)基中的Aβ含量
　　分別取各組培養(yǎng)基，2500r．min-1離心20min，取上清。各加入抗Aβ1-16單克隆抗體W0-2（德國(guó)海德堡大學(xué)分子生物學(xué)中心提供）5μg，蛋白質(zhì)G-agarose 25μl（BM公司），于室溫旋轉(zhuǎn)混合4h。離心（2500r．min-1，20min）后棄上清，沉淀物用10mmol．L-1 Tris緩沖液（pH　7．4）洗滌3次，加2×加樣緩沖液各25μl，于95℃變性10min。離心，取上清上樣。采用100g．L-1Tris-Tricine 凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（350mA，40min）。NC膜置于PBS（pH7．5）中煮沸5min，室溫下以100g．L－1脫脂奶粉（溶于PBS）封閉1　h，PBS漂洗3次，加入一抗W0-2（體積比1∶2000稀釋于2．5g．L－1牛血清白蛋白的PBS中）室溫下孵育1h。PBS漂洗后加堿性磷酸酶偶聯(lián)抗鼠IgG（體積比1∶2000稀釋于2.5g．L-1牛血清白蛋白的PBS中）室溫孵育1　h，用PBS漂洗后以BCIP/NBT系統(tǒng)染色。
 
　　1．3　RT-PCR
　　移去培養(yǎng)基的細(xì)胞用PBS洗滌，用RNA提取試劑（Life Technologies公司產(chǎn)品）及其提供的方法提取總RNA，并用該公司推薦方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。

 
　　PCR APP695片段，上游引物5′-CTG CCC GGT TTG GCA CTG CTC-3′，下游引物5′-CTT GCA CCA GTT CTG GAT G-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度294bp。PCR反應(yīng)條件，95℃3min后；94℃變性30s，60℃退火1min，70℃延伸1.5min；共35個(gè)循環(huán)，最后72℃10min。內(nèi)參照采用3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度572bp，擴(kuò)增條件詳見(jiàn)文獻(xiàn)［9］。擴(kuò)增完畢后兩種PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

　　1．4　結(jié)果統(tǒng)計(jì)
　　Western印跡結(jié)果經(jīng)AGFA ARCUS Ⅱ掃描儀讀取，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果經(jīng)Kodak數(shù)字照相機(jī)拍照，采用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software軟件系統(tǒng)定量分析，吸光度數(shù)值用SPSS軟件單因素方差分析及配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

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