乙肝病毒基因檢測必須重視的幾個問題

   乙型肝炎病毒基因檢測技術（包括定性和定量）尚不完善，有些問題甚至比較嚴重，亟待解決。近年來，隨著基因檢測技術臨床應用范圍的不斷擴大，尤其是在病毒性肝炎的診斷和療效觀察方面，基因檢測所發揮的作用越來越大，因此，對基因診斷技術本身的要求也越來越高。本文根據我們的研究積累和臨床實踐，對乙型肝炎病毒基因檢測技術方面存在的幾個問題提出一些個人看法，希望引起重視。
    一、要合理選擇基因檢測方法
    最常用的基因檢測方法是雜交法和PCR法，兩種方法各有優勢，但各又有不盡如人意之處。比較肯定的是：雜交法的特異性優于PCR法，PCR法的敏感度勝過雜交法。
    目前在檢驗方面，膜斑點雜交技術正逐步被微孔板雜交技術取代，也正是由于在微反應板上操作要比在硝酸纖維膜或尼龍膜上簡便和精確得多，雜交法基因檢測技術再次受到青睞。美國原Chiron公司發明的bDNA定量檢測技術在很短時間內得到普遍認可就是很好的例證。bDNA技術不僅操作簡便，而且由于采用了信號放大探針，提高了靈敏度；更由于檢測系統中的夾心探針系化學合成的寡核苷酸，特異性進一步提高[1,2]。由于成本過高，目前國內主要將bDNA技術用于HBV、HCV基因的定量分析。更多的檢驗部門仍采用膜斑點雜交法定性檢測HBV基因。
    作為一種分子生物學研究手段，自90年代初以來，PCR技術對生命醫學的貢獻和還將發揮的作用是無法估量的，大家熟知的、目前進展十分迅速的人類基因組計劃，如果不依靠PCR技術來完成基因篩選、克隆和測序的工作，要在限定的時間內完成這樣一個龐大的計劃是不可能的。PCR技術不僅是一種研究手段，更是一類多功能的檢驗技術。在用于臨床實驗室診斷方面，PCR有其獨特的優勢。相對而言，近幾年來基因定量PCR發展速度更快，其中競爭PCR和熒光PCR似成為當前的焦點話題。國內已有數個試劑公司開發了定量PCR的產品（包括定量PCR儀）。
    無論是基因定性還是定量檢測，是選擇雜交法還是PCR法，我們應當避免人為的好惡，從技術條件、臨床需要、檢測成本等多方面綜合考慮。由于經驗和知識的局限性，臨床醫生更多關心的是檢測的結果，對檢測過程或檢測技術本身可能存在問題缺乏了解。就HBV基因檢測而言，有一個重要問題需要在此特別提出：基因組和基因檢測的差別及其對臨床診斷可能帶來的影響。基因組和基因的關系可以簡單地理解成基因組是一個整體，它由多個功能不同的基因組成，決定生物體的遺傳性狀；而基因是個體，表達某一種產物發揮作用，或具有調節功能。PCR法只能檢測某一個基因，或某一個基因的一部分（稱之為基因片段）。比如，HBV基因組全長3.2kb左右，PCR法一般只是選擇S或C基因300500bp的片段進行擴增。以后還將談到，由于擴增時必須使用引物，引物3’端一個堿基的突變將導致假陰性結果。而雜交法（bDNA或酶聯夾心雜交）檢測的則是HBV的基因組[3]。48組短的寡核苷酸（堿基數30個左右）在不同位點與HBV DNA雜交，其中10組是捕獲探針，其余為信號檢測探針。在有點突變的情況下，通過雜交法仍能保證有效地捕捉到目的基因，包括不同HBV基因亞型，在敏感度范圍之內，完全可以避免發生假陽性和假陰性的結果。
    二、要重視血清標本的正確處理
    蛋白酶裂解后酚氯仿抽提，已經成為分離和提取血清標本中HBV DNA的“經典”方法。最近幾年，為簡化操作過程，有人采用柱抽提法，更有一些試劑公司提供某種“保密”試劑（大多是蛋白酶之類的裂解物），投入血清后再煮沸數分鐘，即可獲得用于PCR的模板。我們認為，無論是經典方法還是各種改良法，都必須關注以下三個要點：第一，目的基因的得率；第二，操作程序的簡繁程度；第三，材料和時間的消耗。
    我們比較了包括蛋白酶裂解-酚氯仿抽提、堿變性、柱抽提、加蛋白酶K裂解后煮沸和血清直接煮沸等7種血清標本處理方法，對PCR擴增效率的影響，結果發現，血清直接煮沸法的擴增效率最高；經典的蛋白酶裂解-酚氯仿抽提法，不僅操作過程煩瑣，而且目的基因的得率較低；柱抽提法雖然簡化了一些步驟，但耗材昂貴，而且得率明顯低于直接煮沸法。我們也嘗試了用血清標本直接作為模板進行PCR，結果擴增效率最差，可能是血清中未經滅活的某些成分抑制了Taq酶活性的緣故[4]。上述結果表明，血清直接煮沸法，不僅操作十分簡便、省材省時，而且HBV DNA的得率最高（大于70%），是HBV基因檢測過程中血清標本處理的最佳選擇。
    從上述結果引出這樣兩個問題：第一，有沒有必要采用套式（亦稱巢式）PCR，以提高血清HBV DNA的檢測率。如果能首先解決好處理標本過程中目的基因的得率問題，那么我們就可以取得事半功倍的效果，在一定范圍內還可以提高PCR法的特異性。第二，由于不同的抽提方法，HBV DNA的得率不同，因此，如果沒有統一的血清標本處理方法，那么基因定量檢測的準確性如何得到保證呢？這個問題在作PCR定量時顯得尤為突出（雜交法定量若采用血清抽提物來檢測，同樣存在這個問題）。定量PCR法的原理是把“反應管”中的目的基因指數級地擴增到一定水平，再通過產物雜交，并與設定的內參照對比，推算“反應管”內的目的基因含量，并不等于原待測標本內的真正含量，因此血清標本處理過程種的目的基因的丟失及丟失量均無法計算。熒光PCR同樣會因標本處理不當，使得定量結果不可靠。
    綜上所述，任何基因定量手段必須采取統一的標本處理方法，同時還必須對確認的最佳方法進行反復比較，以確定其目的基因的得率。我們推薦血清直接煮沸法，優越性已如前所述。
    三、要解決由于基因突變所致PCR法假陰性的問題
    1998年以前，在PCR技術普遍應用于HBV DNA定性檢測的一段時間內，我們常發現，某些HBsAg（+）、HBeAg（+）、抗HBc（+）病人，血清HBV DNA檢測陰性，似與病情不符。最近，我們將這部分標本采用酶聯雜交法，以及多對引物PCR法復測，發現絕大多數標本HBV DNA陽性，少數與敏感度不夠有關，過去的結果是假陰性。為進一步探討假陰性的原因，我們改變了原來用于PCR擴增的引物序列，即同時或分別去除兩根引物3端的最后一個堿基，再對上述HBV DNA陰性標本行PCR擴增，結果陽性。
    眾所周知，PCR引物設計必須遵循一定原則，選擇待測目的基因的保守區序列來設計引物，是首先要遵循的原則之一。乙型肝炎病毒基因組的S區基因最保守，C基因次之。我們曾比較過S區和C區引物，對乙肝病人血清標本擴增結果，發現C區引物的陽性率為S區的70%左右。但即使是S區基因，也有一些突變頻率較高的區域或位點。最早確認HBV基因擴增引物的作者，采用了經驗性的方法，即選擇多對S區基因引物，擴增大量乙肝病人的血清標本，篩選出陽性率最高的一對引物。因為是“最高”，不是全部，所以不可避免地存在漏檢或假陰性。從整體上看，PCR的漏檢率可能很低，但漏檢如果發生在某一個具體病人則是100%。這里也同樣產生了兩個問題：第一，如果某一項檢測技術不能百分之百地避免假陰性，那么我們還有沒有可能采取更積極的措施，以最大限度地減少假陰性？第二，臨床醫生是否對HBV DNA檢測技術的局限性有足夠的認識？是不是僅憑一張檢驗報告的陽性或陰性結果，作出HBV感染是與否的判斷？
    與經驗醫學不同，現代醫學要求臨床醫生必須不斷更新知識，必須隨時掌握各種現代診斷技術的基本原理和應用范圍；同時，保持與臨床檢驗人員的經常性溝通也是提高和體現臨床醫生診療水平的一個重要方面。就HBV基因檢測技術而言，我們認為，對有疑問的陰性結果，應當采用雜交或多對引物PCR等方法來補救。
    四、如何處理PCR產物污染的問題
    PCR技術因靈敏度很高和操作相對簡便而在臨床上被廣泛應用。理論上，每一反應管內只要有一個基因存在就可能被擴增至可觀察水平，而在實際用于HBV基因檢測時，靈敏度也達到了100個基因/ml的水平。靈敏度過高可能會導致假陽性率增加，這是任何檢測技術無法避免的事實。在導致PCR假陽性的因素中，產物污染是最嚴重、但又是可以避免的因素之一。在如何正確使用PCR技術，以提高臨床診斷水平這個問題上，我國曾為之付出過沉重的代價。防止PCR產物污染，以避免假陽性和提高PCR診斷技術的穩定性已成為急待解決的問題。因噎廢食，禁止使用PCR技術顯然是不明智之舉，但良策是什么？出路在哪里？
    采用一種能識別核酸雙鏈分子中的UTP并降解核酸的UNG酶，在下一次PCR之前對模板及其它反應物進行處理，可以防止因產物污染所致的假陽性。目前我國國家藥政部門在接受PCR相關檢測試劑盒申報時，已經把是否采用了UNG酶作為審批條件之一。但在現階段還存在一些技術問題，其中UNG酶的活性保存非常重要。如果使用了失活的UNG酶，同時檢驗人員因為知道使用了UNG酶系統，而放松PCR產物的常規處理，將會導致更為嚴重的后果。另外，目前UNG酶的造價不低，每一檢測人份的費用上升比較明顯。但隨著重組UNG酶生產和純化技術的成熟，造價將會降低。今后，UNG酶及其相應的系統將成為常規PCR檢測試劑盒的組份。
    然而，我們不能因為UNG酶系統的應用，而疏于PCR操作過程的規范化。事實上，自PCR技術誕生之日起，為保證實驗研究的順利開展和臨床檢測的精確可靠，發明人就已經明確規定了應用PCR技術必須具備的實驗室條件、人員技能和各種防污染措施。比如：具備三間可通風、進出有序和功能不同的工作室；各室配備專用移液器并不得互換使用；使用帶過濾芯的一次性移液頭；每次反應均要設置陰、陽性對照；檢驗人員必須接受專門訓練，等等。我們的實踐經驗表明，只要嚴格按照上述規定操作，就完全可以避免產物污染所造成的假陽性。因此，我國今后仍必須在實驗室管理方面加大力度，除了對試劑盒嚴格把關外，還要堅決取締缺乏條件（包括實驗室和人員條件）的檢驗機構開展常規PCR檢測。
    五、基因定量檢測不應該對靈敏度提出過高要求
    與反映機體疾病嚴重程度的某些生化指標不同，病原體基因檢測結果的“有”和“無”（定性）要比“高”和“低”（定量）的意義更大。目前，對許多感染性疾病而言，血液和組織內病原體含量的高低與組織損傷程度、對治療的反應性以及預后的關系等都未完全闡明。病原體基因定量分析只有在HBV、HCV、HIV等病毒感染方面的應用價值得到了肯定[5，6]。
    從技術角度考慮，靈敏度、特異性和精確度是考核基因定量分析方法的重要指標，最理想的是這三項指標均優；但從臨床工作的需要來看，針對不同病人和疾病的不同階段，對檢測技術參數的要求有所側重。以HBV基因定量為例，使用干擾素抗病毒治療的病人，判斷療效的重要手段之一是觀察HBV基因含量的變化：在治療后的最初13個月，病毒基因呈對數級地下降，往往預示有反應性；繼之，至某一階段降至雜交法的敏感度以下，最終病毒可能被完全清除。PCR定量技術可以把敏感度提高到檢測每毫升100個拷貝的水平[7，8]，但低于雜交檢測cut-off值（如bDNA為700000拷貝/ml）的HBV基因量，即足以充分反映抗病毒治療的效果，再進一步量化的意義不大，在一定時間內作定性檢查即可。因此，我們認為，在建立和開發各種基因定量分析技術的過程中，不要脫離臨床實際過于強調靈敏度。
    六、基因檢測和免疫學檢測技術具有互補性
    診斷HBV感染的免疫學試驗是著名的“兩對半”，又稱之為HBV免疫標志物。過去由于無法對HBV感染作病原學檢查，曾一度經津津樂道于分析“兩對半”檢測結果及其各種組合形式與感染狀態、傳染性及對治療的反應性等問題之間的關系。最典型的例子莫過于把所謂“血清轉化（serum conversion）”，即HBeAg消失，出現抗-HBe看作抗病毒治療有效的標志，后來發現在這些發生了“血清轉化”的病人中，有部分病人系病毒在藥物（如干擾素）的選擇或免疫壓力下產生了前C基因突變，不表達HBeAg，但血清HBV DNA則陽性，甚至含量很高。病毒基因變異所致的一系列病毒表型的改變，向免疫學診斷提出了嚴峻的挑戰。基因診斷（包括突變基因分析），技術很好地解決了這個問題。有人甚至捕捉到這樣一個重要信息：在約6%的抗-HBs陽性HBV感染者的血清中，檢出HBV DNA。使我們認識到，HBV S基因變異形成突變的包膜蛋白，使一貫被認為是保護型抗體的抗-HBs失去中和病毒的作用。
    以上我們從一個側面闡述了基因檢測的重要性，但我們不能因此而斷言病毒基因檢測可以取代免疫學檢測。基因檢測所顯示的優越性也恰恰是它的缺陷之所在，因為我們只能通過它來判斷病原體的有無和量的多少，至于病原體進入體內之后，機體作出了何種反應？程度如何？反應的結果如何？等等，基因檢測結果不能對此類問題作出全面的回答。眾所周知，感染后的免疫應答，包括體液和細胞免疫應答，是感染病學和免疫學的重要研究內容，也是判斷被感染者病情、治療反應、預后，以及流行病學調查的重要依據。客觀地講，基因檢測和免疫學檢測技術在目前應當互補共存，絕大多數情況下兩者缺一不可。
 

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