淋病奈瑟菌對氟喹諾酮類耐藥性研究進展

淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)簡稱淋球菌，淋球菌是性傳播疾病淋病的病原體。淋病奈瑟菌常引起泌尿生殖道的化膿性感染，也可引起泌尿生殖系統之外如眼睛、口咽、直腸、盆腔等部位的感染。

50年代，喹諾酮類藥物用于治療淋病，效果較好，即使對于產青霉素酶和對四環素耐藥的菌株也有很強的殺菌活性。隨著抗菌藥物的廣泛應用，在抗菌藥物選擇性壓力的作用下，淋病奈瑟菌耐藥株逐漸增多。近年來大量研究表明淋病奈瑟菌對環丙沙星等喹諾酮類藥物敏感性降低直至耐藥，因此引起了研究者的高度重視。

 

一、淋病奈瑟菌對氟喹諾酮類藥物耐藥概況

喹諾酮類藥物有多種，因很多結構含氟，也稱為氟喹諾酮類藥物，其典型的代表藥物為環丙沙星。80年代末，鑒于質粒介導的高度耐受青霉素和四環素的淋病奈瑟菌的出現和流行，世界衛生組織及美國疾病控制中心不再推薦青霉素和四環素作為治療淋病的首選藥物，以新的藥物如第三代頭孢菌素、大觀霉素及喹諾酮類藥物等取而代之。起初，喹諾酮類藥物對淋病奈瑟菌包括對青霉素和四環素耐藥在內的菌株有很好的抗菌活性，但隨著該藥的廣泛應用，近年來人們發現淋病奈瑟菌對喹諾酮類藥物敏感性明顯降低，甚至出現耐藥現象。

 

1.國外報道淋病奈瑟菌對氟喹諾酮類藥物耐藥狀況：英國首先報道淋病奈瑟菌對環丙沙星的敏感性下降，患者對劑量為250mg環丙沙星口服液治療無效。日本學者對6株淋病奈瑟菌臨床分離株和5株WTO標準參考菌株的諾氟沙星攝取量和蓄積量進行了檢測，發現4株耐藥株的平均初始藥物攝取量及20min后菌體內藥物蓄積量明顯低于7株敏感株。有研究對澳大利亞1984~1990年間2141株淋病奈瑟菌進行檢測，發現有43株為喹諾酮類藥物耐藥；進一步跟蹤調查顯示，淋病奈瑟菌對喹諾酮類藥物耐藥率有迅速增長的趨勢。

 

2.國內報道淋病奈瑟菌對氟喹諾酮類藥物耐藥狀況：欒玉泉等對2005年1月至2007年12月大理市第一人民醫院108例淋病奈瑟菌臨床分離株進行耐藥性檢測，發現其對喹諾酮類藥物的耐藥率為98%。

 

楊勝輝等采用瓊脂稀釋法調查了衡陽地區淋病奈瑟菌流行株對抗菌藥物的耐藥狀況，結果發現101株淋病奈瑟菌對環丙沙星的耐藥率為91.1%。

 

王蓓等對南京、徐州、無錫地區的2004~2005年間的淋病奈瑟菌臨床分離株進行耐藥性檢測，發現上述地區淋病奈瑟菌對環丙沙星的耐藥率均為100%。

 

謝國艷報道上海地區淋病奈瑟菌臨床分離株對環丙沙星的耐藥率為100%，其中高水平耐藥為73.3%，低水平耐藥為26.7%。

 

從上述情況來看，淋病奈瑟菌對氟喹諾酮類藥物耐藥十分嚴重，因此研究其耐藥機制，為臨床治療淋病開發新藥物提供理論依據具有重要現實意義。

 

二、淋病奈瑟菌對氟喹諾酮類藥物耐藥機制

隨著遺傳學和分子生物學的發展，人們對淋病奈瑟菌耐藥機制的認識越來越清楚，許多研究表明淋病奈瑟菌對喹諾酮類藥物耐藥機制主要存在以下幾個方面。

 

1.作用靶位的改變：此為其主要耐藥機制，早期研究發現淋病奈瑟菌氟喹諾酮耐藥性的發生與細菌染色體上氟喹諾酮耐藥性決定區(quinolone resistance determining region，QRDR)上DNA螺旋酶和拓撲異構酶IV有關。

 

DNA螺旋酶是細菌特有的一種拓撲異構酶，為Ⅱ型DNA拓撲異構酶，由2個GyrA亞基和2個GyrB個亞基組成，DNA螺旋酶A亞基GyrA由gyrA編碼，DNA螺旋酶是氟喹諾酮類藥物的主要作用靶位，gyrA基因的突變可造成藥物靶位點A亞基發生改變，影響其與藥物結合的能力，使淋病奈瑟菌表現出對該類藥物的耐受性；也是造成淋病奈瑟菌產生對喹諾酮類耐藥的主要原因。DNA拓撲異構酶Ⅳ由2個ParC亞基和2個ParE亞基組成，C亞單位ParC由parC基因編碼，gyrA和parC位點改變是淋病奈瑟菌重要的耐藥機制。

 

DNA螺旋酶和拓撲異構酶是細菌生長所必需的酶，二者共同作用以維持細菌體內DNA正常的超螺旋水平，在ATP的參與下能使松弛的環狀DNA轉變為負超螺旋的形式，對DNA的復制、轉錄重組和修復過程起著重要作用。喹諾酮類藥物的原始靶位是細菌的DNA螺旋酶和拓撲異構酶Ⅳ，此類藥物可通過對抗該酶活性，干擾DNA復制、轉錄，破壞DNA結構，使細菌染色體斷裂，導致細菌死亡從而起到抑菌作用。由于編碼DNA螺旋酶A亞基和DNA拓撲異構酶ⅣC亞單位的基因發生點突變，形成編碼另一種氨基酸的密碼子，而使所編碼的酶亞基的氨基酸發生改變，影響到氟喹諾酮類藥物與靶位的結合，從而影響細菌對氟喹諾酮類藥物的敏感性及耐藥性的出現。這是淋病奈瑟菌對氟喹諾酮類藥物產生耐藥的最重要機制。

 

國內外有許多研究已證明gyrA和parC基因突變與淋病奈瑟菌對喹諾酮類藥物產生耐藥有關。有研究對來自印度新德里的63份淋病奈瑟菌臨床分離株用瓊脂稀釋法檢測對環丙沙星的MIC效應，然后全部進行gyrA、parC基因擴增和序列測定，結果表明耐環丙沙星淋病奈瑟菌均有gyrA、parC基因突變。另有研究則通過PCR方法對β-內酰胺酶陽性和陰性的耐環丙沙星淋病奈瑟菌菌株分別研究，發現gyrA、parC基因均有基因編碼的氨基酸發生替代。

 

在作用靶位改變的機制中，gyrA和parC突變位點和突變方式各有特點。國內外學者研究表明，編碼DNA螺旋酶的gyrA基因QRDR區上第91位絲氨酸(Ser91)和95位天冬氨酸(Asp95)堿基的改變是導致淋病奈瑟菌對氟喹諾酮類藥物耐藥的根本原因。有研究已發現gyrA突變所致的gyrA氨基酸取代有：(1)Ser-91→Phe、Tyr、Cys；(2)Asp-95→Gly、Asn；(3)Ala-75→Ser；(4)Ala-84→Pro。而parC突變所致的parC氨基酸取代有：(1)Asp-86→Asn；(2)Ser-87→Arg、lie；(3)Ser-88→Pro；(4)Clu-91→G1y、Gin、Lys；(5)Arg-116→His。

 

淋病奈瑟菌對喹諾酮類耐藥不僅與gyrA和parC突變有關，其耐藥水平高低也與gyrA和parC具體突變的位點及數目有關。研究發現gyrA、parC同時突變的11株淋病奈瑟菌，其MICs均大于1.0μg/ml，而僅有gyrA突變的7株淋病奈瑟菌，其MICs在0.12μg/ml至1.0μg/ml之間，表現出敏感性下降或耐藥。另有研究發現parC基因兩個位點同時突變淋病奈瑟菌的MICs自8.0μg/ml上升至64.0μg/ml，而只有parC單位點突變的菌株，其MICs僅為1.0μg/ml，認為parC基因雙位點同時突變，可引起高度耐藥。國內也有研究發現gyrA和parC基因同時突變菌株的MICs值較高。

 

Alcala等對2000~2001年耐環丙沙星淋病奈瑟菌分離株通過PCR和DNA直接測序法進行gyrA、gyrB和parC基因檢測，發現除1株淋病奈瑟菌外，gyrA基因的Ser91和Asp95發生替代，parC基因則表現為多種變異。有研究用PCR和核酸探針雜交方法分析臨床分離的80株淋病奈瑟菌，發現耐環丙沙星菌株共42株，均有gyrA、parC基因變異，且有1株為中介菌株有單純gyrA基因變異，有93%的變異方式是完全一致的，但環丙沙星敏感菌株未發現任何變異。

 

此外，gyrB基因的突變，在堿基1444和1445位點間有42對堿基插入，導致gyrB蛋白第419位的天冬氨酸被天冬氨酰所替代，抗菌藥物對gyrB蛋白的親和力下降而引起耐藥，但這種耐藥機制比較少見，所起作用不大。

 

可見不同地區喹諾酮耐藥株有特定的gyrA和parC突變模式，這種差異可能與耐藥菌株生物學特性、流行情況、耐藥水平高低、是否多重耐藥等多種方面密切相關。

 

2.膜通透性下降：penB基因是一個編碼膜孔收縮蛋白的基因，其突變引起孔蛋白合成受阻，通道結構改變和功能異常，可使淋病奈瑟菌膜蛋白結構改變，致膜通透性下降，使得抗菌藥物透入細菌受阻，細菌對藥物攝取量減少，從而使得淋病奈瑟菌對喹諾酮類藥物耐藥。這種膜通透性下降也同樣造成淋病奈瑟菌對其他藥物耐藥。

 

3.外排泵作用：淋病奈瑟菌產生對喹諾酮類藥物耐藥的原因還包括細菌能把藥物有效地排出體外，而外排過程是由細胞膜上的脂蛋白在ATP酶催化作用下通過外排泵作用完成的。外排泵能捕獲多種不同結構的化合物，將有毒物質包括殺菌劑泵出體外，從而對抗人體宿主或細胞免疫系統，提高細菌的生存能力。該脂蛋白的過多表達與臨床細菌耐藥直接相關，其編碼基因包括mtr(muhiple transferable resistance)和far(fatty acid resistance)基因系統，通過順式作用因子和反式作用元件來調控該外排泵的表達，使得淋病奈瑟菌能夠對抗糞便中的脂類及膽鹽的毒性，這也是淋病奈瑟菌能在尿道、腸道黏膜表面生存的主要原因。

 

mtr基因系統存在于淋病奈瑟菌的染色體DNA上，該基因系統是一個多重可傳遞耐藥操縱子，包括mtrR和mtrCDE基因，其中mtrR為抑制基因，mtrCDE為結構基因，mtrR和mtrCDE分別編碼相應的蛋白質(mtrR、mtrC、mtrD、mtrE)。mtrCDE蛋白存在于細菌細胞膜上，其中mtrC為膜融合蛋白，mtrD為外排蛋白，mtrE為外膜通道蛋白，mtrC使位于細胞膜的mtrD與外膜的mtrE相連接，三者緊密相連構成了跨膜的能量依賴性外排系統，該系統依賴質子耦聯交換產生的質子驅動力將胞內及胞周間隙的底物泵出細菌。

 

mtrR基因控制mtrCDE的表達。mtrR編碼一個含210個氨基酸殘基的蛋白，該蛋白作為轉錄阻遏物結合丁mtrCDE基因上而影響其轉錄。mtrCDE基因位于mtrR基的下游，其編碼的蛋白質位于淋病奈瑟菌細胞膜上，該蛋白復合物能在ATP酶作用下通過外泵機制把藥物泵出細胞外，其合成量的多少決定淋病奈瑟菌的耐藥程度。由于mtrR因編碼轉錄阻遏蛋白，mtrR基因突變使mtrR基下游的mtrCDE基因轉錄開放，細胞膜脂蛋白中受其控制的mtrCDE蛋白復合物表達增加，外排泵系統功能增強，增加對多種抗菌因子的抵抗力。

 

4.質粒介導：質粒介導在淋病奈瑟菌對喹諾酮耐藥性的產生中具有重要作用。有研究將攜帶有耐喹諾酮類藥物菌株gyrA基因的質粒導入攜帶正常gyrA基因的淋病奈瑟菌菌株中，結果發現原先對喹諾酮類藥物敏感的菌株對其產生了耐藥性。

 

三、小結

綜上所述，淋病奈瑟菌對喹諾酮類藥物的耐藥狀況較為嚴重，喹諾酮類藥物已經不適用于臨床治療淋病。淋病奈瑟菌對喹諾酮類藥物的耐藥機制有以下幾種：(1)作用靶位的改變：gyrA基因突變是必需的。gyrA的基因突變有單位點或雙位點突變，雙位點突變具有協同作用，可使淋病奈瑟菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性增高。gyrA基因突變主要有：Ser→91→Phe(Tyr)和Asp→95→Asn(Gly)。在gyrA突變的基礎上，parC基因突變使淋病奈瑟菌獲得高水平的耐藥性。parC基因的第86、87、88及91位密碼子均可發生突變。目前檢出的淋病奈瑟菌突變類型有：gyrA單位點突變，gyrA雙位點突變或gyrA單位點突變加parC單位點突變。(2)膜通透性下降。(3)外排泵作用。(4)另外，質粒介導也是淋病奈瑟菌對喹諾酮類藥物耐藥很重要的一個方面。隨著抗菌藥物的廣泛應用，淋病奈瑟菌的耐藥性問題會更加突出，因此更深入地研究淋病奈瑟菌的耐藥機制對于淋病的治療和預防非常重要。

 

(侯臨平，淋病奈瑟菌對氟喹諾酮類耐藥性研究進展[J]中華實驗和臨床感染病雜志電子版2011年11月第5卷第4期：57-59)

 

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