白癜風動物模型的研究進展

　　白癜風是一種常見的后天性色素脫失性皮膚病,本病主要影響美觀, 給患者精神上帶來巨大的壓力。由于病因尚不完全清楚,目前尚無特效的根治方法。有關其病因及發病機制學說眾多，有自身免疫學說、黑素細胞自身破壞學說、神經化學因子學說、黑素細胞生長因子缺乏學說、遺傳因素等［1］。鑒于此，對于白癜風目前的實驗中尚無針對病因制造的病理模型。但是對白癜風模型的研究仍在不斷進步發展，建立一個合理的模型有助于我們攻克白癜風這一頑疾。本文對目前常用于白癜風的動物模型及模型制備方法進行綜述。

　　1 常用模型適宜的動物模型可成為研究治療藥物中有用的藥理學工具，白癜風的動物模型在研究白癜風的發病機制和治療方法上可發揮重要的作用。

　　1.1 SL雞 Smythline(SL)雞［2,3］是人類自身免疫性白癜風的動物模型，由美國馬薩諸塞州大學Smyth教授在20世紀70年代創立。SL雞白癜風的發生是由兩個相互影響的因素造成，即黑素細胞固有的缺陷和針對黑素細胞的自身免疫，最終導致黑素細胞缺失。這一模型在疾病病理的許多方面，特別是在免疫學方面與人類的白癜風極為相似。

　　SL雞最早是在一籠褐色雞中被偶然發現的一只白色母雞，從它翅膀上的標記看，在孵化出殼時為褐色。經過反復遺傳選擇實驗，Smyth發現，其色素的脫失并不遵循孟德爾法則。SL雞與它的雙親有各自不同的主要組織相容性復合物(MHC)抗原。SL雞一般在孵化后6～12周其羽毛發生色素脫失。SL雞可伴有不同程度的與鳥類換毛時不同的斑禿樣或普禿樣外觀改變，酷似人類的斑禿。

　　人類許多白癜風患者體內有循環抗黑素細胞抗原的自身抗體，抗體的存在與疾病的活動性和皮損面積相關。這些自身抗體能通過補體介導途徑和抗體依賴的細胞毒作用破壞黑素細胞。在SL雞模型中，SL雞在發生色素脫失的前幾周，血清中可檢測到抗黑素細胞抗體，這種自身抗體可與人和鼠黑素細胞發生交叉反應。經免疫印跡法測定，這一循環自身抗體能與黑素細胞中65～80kD中的多種蛋白結合，而正常色素的Smyth雞卻沒有這種抗體。已知哺乳動物的3種黑素細胞蛋白亞型即酪氨酸酶、TRP-1和TRP-2均在65～80kD這一分子量范圍內。經RNA印跡證實哺乳動物TRP-1是SL雞自身抗體的主要靶抗原［4］。細胞介導的免疫反應在這一模型中也能很好的體現。SL雞在發生色素脫失前和色素脫失的整個過程中，其新生羽毛毛囊中的T細胞浸潤大量增加，αT細胞受體與βT細胞受體之比增加。在淋巴細胞浸潤的早期，浸潤細胞主要為CD4+T細胞，在色素脫失發生后，CD4+／CD8+比值下降，浸潤細胞主要為CD8+細胞，血液中淋巴細胞無改變，但中性粒細胞在色素脫失前增加［5，6］。

　　1.2 C57BL小鼠 C57BL小鼠［7～10］是由Little從Abby Lathrop小鼠近交培育而得,有C57BL /6、C57BL /6J、C57BL /10等亞系。其中C57BL /6JLer-vit/vit小鼠是C57BL /6J的同源突變系,是白癜風的鼠模型。與白癜風相關的研究主要有毛囊黑素細胞增殖與分化的調節與白癜風復色的研究以及鼠白癜風的遺傳等。C57BL小鼠適合于研究毛發色素形成,以及在毛發生長過程中角質形成細胞、黑素細胞和成纖維細胞之間的相互作用研究。如果在這一模型中加入某些干擾因素,通過組織學、生物化學、分子生物學、免疫學等技術對毛發生長狀態進行研究,可直接了解皮膚黑素細胞黑素形成的能力和皮膚色素的變化情況。有人將處于毛發休止期延長期的C57BL /6J小鼠部分毛發拔除,刺激局部的毛囊從休止期進入生長期,同時在局部應用胎盤提取物,通過對毛發生長過程的觀察了解胎盤提取物對黑素細胞增殖和分化的作用。其機制可能因為白癜風皮損表皮中黑素細胞消失,但局部毛囊外根鞘存在多巴陰性的黑素母細胞,通過刺激或調節這些細胞的生長、遷移和黑素生成是白癜風復色的必要條件。

　　C57BL小鼠的應用范圍較廣，與白癜風相關的研究主要有毛黑素細胞增殖與分化的調節和白癜風復色的研究，以及鼠癜風的遺傳等［2］。

　　1.3 豚鼠［10～11］ 遠交群豚鼠，按其毛色可分為白色、黃褐色、黑色等。其中黃褐色豚鼠表皮中有適量的對UVB和PUVA敏感的功能性黑素細胞，經紫外線照射后的皮膚可產生清晰可見的色素沉著過度，表皮中多巴陽性黑素細胞數量較未照射部位增加3～4倍，黑素細胞樹突增加。這一現象和過程類似于人類紫外線誘導的色素沉著，特別是黃種人的曬黑現象。因此，這一模型常用于研究紫外線誘導的色素沉著和白癜風治療中的補骨脂素光化療法，以及用于酪氨酸酶抑制劑和防曬劑的藥效學研究。

　　1.4 其他1.4.1 其他動物 除SL雞外,還有白癜風狗、貓和馬等動物體內有抗黑素細胞抗體,這些抗體識別的黑素細胞抗原與人類白癜風自身抗體所識別的黑素細胞抗原相似,說明動物白癜風與人類白癜風有相似的免疫反應。除C57BL小鼠和豚鼠外,還有無毛小鼠、無毛狗和無毛豚鼠等動物,表皮中均有活性黑素細胞,對環境因素的刺激敏感,在白癜風相關研究領域中也是可選擇的動物模型［12］。

　　1.4.2 體外試驗模型［3，12，13］ 有研究利用小鼠黑素瘤細胞或環切術后患者包皮制備單細胞懸液,培養傳代,經DOPA染色為陽性的,證明為黑素細胞,經體外系統給藥,觀察藥物對黑素細胞的細胞毒作用及藥物對黑色素細胞增殖的影響。并觀察藥物對黑色素細胞中酪氨酸酶活性、黑素含量的影響,以及對黑色素細胞中酪氨酸酶和酪氨酸酶相關蛋白基因表達的影響等。

　　2 常用模型制造方法2.1 化學脫色法2.1.1 過氧化氫模型 白癜風動物模型的制備國內較早期就已有報道［13］。根據黑色素不穩定、易受強氧化劑過氧化氫破壞的特性,采用5%過氧化氫外用(每次0.5ml,每天2次,脫毛區涂抹20～40天) ,使豚鼠黑色皮膚脫色,建立動物模型。測定了模型動物血液中膽堿酯酶ChE活性及Ig含量,并取用藥部位皮膚進行黑色素染色,觀察黑色素毛囊數及皮膚黑色素分布情況。發現用過氧化氫后,MAO明顯增加, ChE活性下降, Ig明顯增加,豚鼠皮膚表皮基底細胞、棘層黑色素及毛囊黑色素明顯減少,用藥時間越長,效果越顯著,說明用過氧化氫后有模擬白癜風的作用。

　　因皮膚發生局部病變后可生成過量的自由基,使生物膜脂質雙層中的不飽和脂肪酸過氧化,形成脂質過氧化產物,從而使膜結構及其功能發生障礙。因此,測定過氧化脂質的代謝產物MDA含量可反映其結構和功能的變化。

　　因酪氨酸酶是生物體合成黑色素的關鍵酶,該酶催化黑色素在黑色素細胞中合成。在合成中首先由酪氨酸轉變成多巴,多巴在酪氨酸酶作用下氧化成多巴醌,多巴醌經環化成某些中間產物,最后生成黑色素。如果酪氨酸酶活性減弱,將影響黑色素的生成。據報道,白癜風患者的酪氨酸酶活性降低,血液粘稠度明顯增加。因此,有人［15］利用上述化學脫色法復制的白癜風動物模型,觀察了動物血液中酪氨酸酶含量及血液流變性指標的變化,發現連續50天外涂過氧化氫后,動物血中酪氨酸酶含量減少,血液流變性指標明顯升高。說明用化學脫色法復制的白癜風動物模型與臨床證型相一致,有代表性。另有人［16，17］利用該模型評價內服或外用中藥對酪氨酸酶含量和血液流變學的影響,發現用藥后不但可使模型動物黑色素毛囊數明顯增多,而且可使膽堿酯酶活性恢復接近正常,使血液中酪氨酸酶含量明顯增加,使血液流變性改善,提示該模型可作為評價藥物治療白癜風的模型。

　　2.1.2 氫醌模型［18～20］ 氫醌：氫醌又名對苯二酚。它由苯胺氧化成苯醌，再經還原而成。有人選用性質更為穩定的氫醌建立了豚鼠皮膚涂抹脫色模型。氫醌對皮膚具有脫色素作用,其機制可能是通過阻斷了酪氨酸酶,使酪氨酸不轉化為多巴和多巴醌,從而抑制黑色素合成,造成在形態上黑色素的表現與白癜風相似。但也有人認為,氫醌脫色實質上是一酪氨酸酶介導的細胞毒作用。氫醌分子易擴散進入黑素細胞的黑素小體,阻斷黑素生成途徑的一個或多個步驟,同時氫醌在酪氨酸酶作用下被氧化生成有毒性的半醌基物質,后者使細胞膜發生脂質過氧化,破壞細胞膜性結構,最終導致細胞死亡。氫醌臨床上主要用于黃褐斑和炎癥后色素沉著的治療。各個國家使用的濃度不一樣，從4%～8%。一般低濃度時，不良反應少，但其效果稍差，起效時間也長，濃度高時，則結果相反。氫醌應用的局部不良反應有局部刺激性、接觸性皮炎、色素減退斑。色素減退一般可以復色，但有時會持久存在，特別在高濃度時更易發生［21］。

　　有研究結果表明不同濃度的氫醌其脫色作用的機制可能不同,低濃度時以抑制酪氨酸酶活性為主,高濃度時主要是細胞毒作用。有人［20］利用上述模型比較評價了8-甲氧補骨脂素( 8-MOP)脂質體凝膠與其等濃度的其他劑型(酊劑、凝膠劑)對白癜風模型豚鼠的療效,考察了各種藥物對動物表皮毛囊黑色素生成、血清膽堿酯酶及皮膚丙二醛(MDA)含量等指標的變化。結果發現8-MOP各種劑型均對造模動物毛囊黑色素生成、血清膽堿酯酶及MDA含量等有明顯影響,其中尤以8-MOP脂質體凝膠效果更好。本模型制作中應注意兩點:一是脫毛要及時,一般3～4天脫毛1次;再者在涂藥時要反復擦,盡量使之滲透,增強脫色效果。

　　2.2 其他常用脫色劑［21］2.2.1 壬二酸 又名杜鵑花酸，是天然的直鏈飽和二羧酸-C9 二羧酸。1978年它從糠秕馬拉色菌培養液中分離出，并認為花斑癬患者的脫色斑是由它引起的。它可選擇作用于功能活躍的黑素細胞，對正常的黑素細胞影響較小。體外試驗表明它能抑制酪氨酸酶活性，減少黑素的形成，并對黑素細胞的超微結構有損傷。

　　2.2.2 曲酸 又名麴酸，使用濃度一般為1%-3%，其脫色機制是酪氨酸酶含有金屬銅離子，曲酸能與銅離子螯合，影響酪氨酸酶活性， 從而減少黑素的合成。曲酸的脫色效果比2%氫醌差。

　　2.2.3 油溶性甘草提取物P-T（LPT）及甘草根亭（liquiritin） 它們均為甘草提取物，它具有脫氧皮質酮樣作用，但沒有皮質類固醇的副作用。該藥脫色原理：（1）甘草根亭的黃酮原子團可離解黑素分子的吡喃環；我們的體外實驗研究表明：中藥單體甘草酸單胺鹽和18a- 甘草酸雙胺鹽能夠抑制酪氨酸酶的活性。（2）抑制黑素的轉運功能。LPT在抑制酪氨酸酶活性上比氫醌強16倍。

　　2.2.4 熊果苷（arbutin） 1988年日本學者Akiu 等從杜鵑花科植物熊果的葉中分離到的具有脫色作用的單體。它是氫醌的一種天然存在形式，分子結構為氫醌-B -D- 葡萄吡喃糖苷，因它含有氫醌基團，其脫色作用可能與此有關。研究發現熊果苷能明顯抑制人黑素細胞和B16鼠黑素瘤細胞酪氨酸酶活性和黑素產生。

　　2.2.5 皮質類固醇 皮質類固醇可影響細胞因子和炎癥介質的產生，也可能直接作用于黑素細胞影響黑素合成。

　　2.2.6 維A酸 1975年Kligam 發現痤瘡患者用維A 酸治療數月后局部皮膚顏色減退，以后應用維A酸與氫醌聯合應用治療色素增多性皮膚病取得較好的效果。維A酸脫色作用的機制可能是：（1）在體外培養B16 和S91惡性黑素瘤細胞加入維A酸，會抑制細胞黑素的形成；（2）加速表皮的更替時間，促進含有較多黑素顆粒的表皮，特別是角質層的剝脫，同時，角質層的剝脫更利于脫色藥物的滲透；（3）可使黑素細胞和角質形成細胞的接觸減少，黑素細胞中黑素顆粒不能及時地輸送到角質形成細胞中。

　　2.2.7 維生素C衍生物 維生素C通過黑素形成的多個環節抑制黑素的產生，如還原黑素中間體和黑素的聚合物，減少多巴和多巴醌類物質形成。但是維生素C在水溶液中和在熱與堿性環境中能被快速氧化而失去活性，因此很難用于外用。

　　2.2.8 其他可以產生脫色作用的物質 N-乙酰基-4-S-半胱胺基酚、不飽和脂肪酸、桂皮酸、沒食子酸、纖維蛋白溶酶抑制劑、SOD、胎盤蛋白、蛋白多糖、蛋白激酶抑制劑、紫芝、半胱氨酸、薔薇科植物（如櫻花、大葉桂櫻）的提取物、山茱萸及西洋甘菊的提取物等均有脫色之效。國外有學者還發現5-氟尿嘧啶與某些增白劑合用，能增強其脫色效果。汞劑原來一直作為常用的脫色劑，但因汞劑能引起外源性褐黃病及對腎及神經系統有較大毒性，目前已棄用。

　　以上物質雖然有脫色的作用，但是并沒有報道將其用于白癜風模型的制備，目前在臨床用于治療色斑、黃褐斑等。

　　3 脫色法制備動物模型的應用龍子江等［22］采用5％氫醌對豚鼠黑色皮膚脫色，初步建立白癜風動物模型，為研究該病提供病理模型，取體重250～300g黑或黑花毛豚鼠60只，隨機分成模型組和正常對照組。脫去背部黑毛5cm×8cm。模型組每天涂5％氫醌0．5ml兩次，正常組涂自來水。分別于涂藥后20、30和40天，各組隨機選10只用20％烏拉坦麻醉，腹主動脈抽血做有關生化檢測，并于用藥部位中心取皮膚1cm×1cm，用中性甲醛固定，常規石蠟包埋切片，用硫酸亞鐵Lillie法進行黑色素染色，隨意觀察50個毛囊，計算其中有黑色素毛囊數。選用5％氫醌對黑或黑花毛豚鼠實驗，結果表明：用5％每醌后，豚鼠皮膚黑色素減少，MAO、Clue、IgG、IgM 和IgA均升高，與臨床報道相符。說明用氫醌后，使動物有模擬白癜風的作用。

　　另外，龍子江等［15］還用過氧化氫脫色制備了動物模型，用于評價模型中酪氨酸酶含量及血液流變性改變，具體做法如下：取黑色或黑花色豚鼠40只，隨機均分為正常組、模型組。脫去黑毛約4cm×4cm后，正常組在脫毛區涂1ml蒸餾水，每天2次；模型組涂5％過氧化氫lml，每天2次，兩組連續用藥50天，末次用藥后40min，用烏拉坦麻醉，自腹主動脈取血。用5%過氧化氫復制白癜風動物模型,該動物血中酪氨酸酶含量明顯下降,血液流變性指標明顯升高,與正常組比較,有明顯差異。說明用化學脫色法復制的白癜風動物模型與臨床證型相一致,有代表性。在本模型制作中應注意兩點：一是脫毛要及時，一般3～4天脫毛1 次；再者在涂藥時要反復擦，盡量使之滲透，增強脫色效果。

　　謝勇等［18］用5％過氧化氫制備白癜風動物模型，查考自制祛白酊對白癜風動物模型的治療效果。楊淑清等［23］用氫醌脫色法制備白癜風動物模型，考察補骨脂素脂質體凝膠對黑素生成及丙二醛含量的影響。

　　參考來源： 《中華醫學實踐雜志》2008年3月7卷3期；《白癜風動物模型的研究進展》；張蘭蘭 閆明

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