拉米夫定治療慢性乙型肝炎耐藥性的基礎(chǔ)與臨床研究

　　摘要

　　拉米夫定(lamivudine)是核苷類似物, 對乙型肝炎病毒(HBV)的復(fù)制有很好的抑制作用. 其主要抗病毒機制是抑制HBV多聚酶的逆轉(zhuǎn)錄酶活性, 有效阻止病毒核酸的復(fù)制合成. 拉米夫定因其具有迅速抑制HBV復(fù)制, 降低病毒載量, 促進(jìn)HBeAg血清轉(zhuǎn)換, 改善肝組織炎癥壞死病變, 延緩肝纖維化進(jìn)程作用, 以及良好的耐受性、安全性和服用方便等特點, 已廣泛應(yīng)用于臨床. 雖然總體上不良反應(yīng)發(fā)生率較低, 但是在臨床繼續(xù)應(yīng)用的幾年后遇到了越來越多的治療問題, 尤其是拉米夫定治療慢性乙型肝炎的耐藥性問題. 現(xiàn)對拉米夫定治療慢性乙型肝炎的作用機制、耐藥性產(chǎn)生及發(fā)生機制、HBV產(chǎn)生耐藥性的分子病毒學(xué)基礎(chǔ)、YMDD變異株的生物學(xué)特性及YMDD變異對病情的影響等作了系統(tǒng)全面的闡述, 并就預(yù)防和處理耐藥性問題提出了應(yīng)對策略, 對拉米夫定聯(lián)合用藥等問題作了回顧與展望.

　　關(guān)鍵詞: 慢性乙型病毒性肝炎; 拉米夫定; 耐藥性; YMDD/YIDD變異; 對策

　　0 引言

　　1995年Dienstag et al[1]發(fā)現(xiàn), 拉米夫定(lamivu-dine)對HBV DNA的抑制作用以來, 世界各地先后進(jìn)行了拉米夫定治療乙型肝炎的Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗. 拉米夫定作為第一個獲美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的口服抗乙型肝炎病毒(HBV)藥物, 其問世推動了慢性乙型病毒性肝炎(CHB)治療的進(jìn)程[2]. 拉米夫定因其具有迅速抑制HBV復(fù)制, 降低病毒載量, 促進(jìn)HBeAg血清轉(zhuǎn)換, 改善肝組織炎癥壞死病變, 延緩肝纖維化進(jìn)程作用, 以及良好的耐受性、安全性和服用方便等特點, 已廣泛應(yīng)用于臨床[3]. 雖然總體上不良反應(yīng)發(fā)生率較低, 但是在臨床繼續(xù)應(yīng)用的幾年后遇到了越來越多的治療問題, 尤其是拉米夫定治療慢性乙型肝炎的耐藥性問題[4]. 拉米夫定(lamivudine, 化學(xué)名稱: 2'''''''', 3''''''''-二脫氧-3''''''''-硫代胞嘧啶, 簡稱LAM, 3TC)為雙脫氧核苷類似物, h, 藥物清除率22.61/h. h), 絕對生物利用度達(dá)86%-88%, 平均半衰期8.41-9.11 口服吸收快(平均吸收時間1.32 拉米夫定在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為三磷酸拉米夫定后對HBV有更強的抑制作用. 拉米夫定最后大部分以原形由腎臟排泄, 可通過胎盤及血腦屏障. 拉米夫定是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑, 最初用于治療HIV感染, 以后發(fā)現(xiàn)對于HBV復(fù)制具有抑制作用. HBV侵入肝細(xì)胞后, 在HBV DNA多聚酶(DNAP)作用下, 先形成共價閉合環(huán)狀DNA (cccDNA), 然后以cccDNA為模板轉(zhuǎn)錄病毒前基因組, 再借助HBV DNAP以前基因組為模板合成負(fù)鏈, 繼而合成正鏈. cccDNA存在于感染細(xì)胞核內(nèi), 是HBV DNA復(fù)制的模板, 不受藥物的影響. 拉米夫定的作用靶點是HBV的RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶(RDDP). 該藥可與DNA合成所需的底物三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)競爭RT上的結(jié)合位點, 結(jié)合到DNA鏈上起到鏈終止作用, 在體內(nèi)選擇性抑制HBV DNAP活性, 競爭性抑制病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程, 從而抑制病毒復(fù)制[5]. 但是由于他不能清除肝細(xì)胞內(nèi)病毒的cccDNA, 未達(dá)到血清轉(zhuǎn)換, 停藥后HBV DNA又可再度復(fù)制.

　　1 拉米夫定耐藥性及發(fā)生機制

　　1.1 耐藥性發(fā)生率 a以后, 并且隨時間的延長不斷增多 目前的研究證實, HBV拉米夫定耐藥變異常發(fā)生在治療0.5[6]. a時, 變異發(fā)生率分別為15% 臨床研究數(shù)據(jù)顯示, 拉米夫定治療1, 2, 4[7], 38%[8]和67%[9]. 隨著治療時間的延長, 耐藥率明顯增加. 近已觀察到有些拉米夫定再治療患者發(fā)生耐藥突變的時間相對提前. 因變異株復(fù)制能力明顯低于原型株, 變異時HBV DNA水平仍低于治療前, 但可伴暫時性ALT升高, 臨床上有輕度乏力、惡心等表現(xiàn). Atkins et al[10]用拉米夫定治療時16%-32%有YMDD變異, wk時, 但80%可消失. 變異者的HBV DNA可持續(xù)陽性, 其中24%的患者ALT升高達(dá)3倍以上, 但組織學(xué)仍有改善, 變異最早可發(fā)生于治療36 mo后變異株可被原株取代, 從而出現(xiàn)HBV DNA“陽轉(zhuǎn)”現(xiàn)象. 治療前HBV DNA水平高, 表明繼續(xù)治療仍有效. 當(dāng)停止治療3-4 HBeAg陽性者易有“陽轉(zhuǎn)”的趨勢, HBV DNA“陽轉(zhuǎn)”時可伴ALT升高. 再次用拉米夫定治療仍可有效, 但變異會再次更快地產(chǎn)生[11].

　　1.2 發(fā)生機制 拉米夫定單用治療CHB可以誘導(dǎo)體內(nèi)病毒學(xué)和生化反應(yīng)血清的復(fù)常, a內(nèi)會出現(xiàn)拉米夫定耐藥突變. 肝組織學(xué)的改善, 但同時也導(dǎo)致了拉米夫定耐藥突變的產(chǎn)生, 超過50%的患者治療3 早期研究認(rèn)為耐藥的HBV突變引起的是病毒復(fù)制的減弱, 從而致病性也隨之減弱, 但隨后的研究表明不完全受抑制的HBV復(fù)制否定了原先的假設(shè). 耐藥突變的病毒通過適應(yīng)選擇出逐步復(fù)制活躍的致病性較強的病毒種類, 并且賦予了HBV以復(fù)雜的免疫應(yīng)答反應(yīng), 而臨床發(fā)現(xiàn)這樣的突變確實帶來較強的致病性: 拉米夫定的耐藥性導(dǎo)致了HBeAg陽性患者體內(nèi)產(chǎn)生低血清轉(zhuǎn)換率, 低度的病毒學(xué)和生化反應(yīng), 不顯著的組織學(xué)改變等, 突變株對拉米夫定敏感性降低, 病情出現(xiàn)反復(fù), 甚至失效[12]. 目前認(rèn)為, HBV對核苷類似物耐藥性的產(chǎn)生與HBV P基因變異有關(guān), 并且HBV P基因變異是多位點的, 以C區(qū)YMDD基序的變異最為重要. 拉米夫定耐藥突變定位于HBV DNA多聚酶逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域上酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸(YMDD)模序上的突變[13]. YMDD位于C區(qū)第549-552aa (即Y549M550D551D552), YMDD中蛋氨酸(M)被纈氨酸(V)或異亮氨酸(I)替代, 變成YVDD或YIDD[14]. 使用新的命名法, 拉米夫定相關(guān)的HBV耐藥株的變異位置和類型為rtM204I/V (C區(qū))±rtL180M (B區(qū)). 最近, 還發(fā)現(xiàn)一種新的變異類型, mo的患者的血清中發(fā)現(xiàn)的, 即YSDD變異或rtM204S變異(以往報告的基本是YVDD或YIDD變異), 這種變異株是從1例接受拉米夫定治療18 體外轉(zhuǎn)染研究也證實了這種YSDD變異株對拉米夫定耐藥. HBV YMDD基序變異引起對拉米夫定耐藥的機制: YMDD變異可引起HBV DNAP空間構(gòu)象發(fā)生改變, 進(jìn)而引起其與拉米夫定之間的作用發(fā)生改變, 與dNTP或拉米夫定的結(jié)合力下降. 根據(jù)HBV野毒株和YMDD變異株聚合酶的酶學(xué)分析和模擬的HBV聚合酶晶體結(jié)構(gòu)特點, 發(fā)現(xiàn)YMDD是HBV DNAP的催化位點, 當(dāng)M變?yōu)镮或V時可導(dǎo)致氨基酸側(cè)鏈的柔性減低, 并在HBV DNAP和拉米夫定三磷酸鹽之間形成空間位阻, 與拉米夫定三磷酸鹽的結(jié)合力下降[15]. 拉米夫定治療表現(xiàn)出機體CD4+和CD8+ T細(xì)胞針對HBV抗原的反應(yīng)的加強. Lin et al[16]認(rèn)為一個CD8+ T細(xì)胞針對拉米夫定耐藥多聚酶抗原表位的反應(yīng)影響了機體對拉米夫定的反應(yīng). 他們解釋了特異性T細(xì)胞的功能和表現(xiàn)型并表明功能性的抗-YMDD細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)與之反應(yīng)和結(jié)果相關(guān), 并強調(diào)了HBV DNAP催化部位非多肽YMDDVVLGA(氨基酸序列203-211)中逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域中的YMDD模序是一個限制性的CTL抗原表位.

　　1.3 分子病毒學(xué)基礎(chǔ) 大多數(shù)生物能夠通過復(fù)雜的機制來維持其遺傳信息的穩(wěn)定性, 而病毒卻相反, 他們處于快速和持續(xù)的基因變異之中. HBV在復(fù)制過程中盡管產(chǎn)生大量的子病毒, 但并不直接殺傷被其感染的肝細(xì)胞. 由于HBV的復(fù)制所需的HBV DNA多聚酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶, 缺乏校正的功能, 因此HBV變異率高于其他DNA病毒10倍左右, 變異的頻率約為(1.4-3.2)×10-5核苷酸替換/位點/a. 從理論上講, 對于任何核苷類HBV藥物, HBV均有耐藥株的可能性, 所不同的是出現(xiàn)時間早晚的差異. 變異病毒的復(fù)制必須有可用的復(fù)制空間, 變異株是通過占據(jù)原來野毒株的位置而獲得復(fù)制空間的, 此過程的前提是原來野毒株的消失, 而原來野毒株能否消失又受其本身的復(fù)制適應(yīng)性、肝細(xì)胞的更新、增殖等影響. 所以只有在擁有新的復(fù)制空間的前提下, HBV耐藥株在肝內(nèi)的數(shù)量才會增加. 在所施加的藥物選擇壓力撤銷后(如停用拉米夫定), 原來的野毒株是否重新出現(xiàn)、出現(xiàn)的時間以及能否成為優(yōu)勢株, 同樣取決于是否還存在野生株及其所占復(fù)制空間的大小[17]. 同時HBV存在若干個血清型, 根據(jù)表面抗原具有兩對相互排斥的抗原決定簇d, y, w, r, 以及表面抗原的共同抗原決定簇a, 可將HBV分出9個基本血清型, 常見的有adw, adr, ayw和ayr. 但研究表明, 血清型的劃分不能完全反映其核酸變異程度. 根據(jù)HBV全基因核苷酸序列異源性≥8%或者S基因區(qū)核苷酸序列異源性≥4%, 將不同病毒株分為不同的基因型[18]. 迄今為止HBV可以分為8個基因型[19-20], 即A, B, C, D, E, F, G和H. B基因型和C基因型之間還可能發(fā)生重組[21]. 但HBV基因型與拉米夫定療效間的關(guān)系目前尚未有明確定論, Kao et al[22]發(fā)現(xiàn), B基因型的HBeAg血清轉(zhuǎn)換率高于C基因型, Zollner et al[23]研究了26例CHB患者對LAM的應(yīng)答, 發(fā)現(xiàn)在adw亞型(主要為基因型B)的患者中, LAM耐藥的發(fā)生率是其他亞型的20倍, Chien et al[24]發(fā)現(xiàn), 基因型C的HBeAg復(fù)發(fā)率顯著高于基因型B. 而Chan et al[25]卻認(rèn)為, CHB患者接受拉米夫定治療后HBeAg的血清轉(zhuǎn)換率與HBV基因型無關(guān).

　　2 YMDD變異株

　　2.1 生物學(xué)特性 過去認(rèn)為和野毒株相比, YMDD變異株的復(fù)制能力顯著降低. 體外YMDD變異株不能像野生型HBV那樣有效復(fù)制, 復(fù)制能力明顯下降. 臨床上也發(fā)現(xiàn), 發(fā)生YMDD變異者在停用拉米夫定之后, 患者體內(nèi)的變異株常常很快被野毒株所取代, 提示YMDD變異株存在復(fù)制缺陷[26]. Liu et al[17]認(rèn)為, 拉米夫定治療后, HBV DNA載量顯著下降, 能容納新的HBV cccDNA的肝細(xì)胞增加, 當(dāng)與野生株密切相關(guān)的YMDD變異株出現(xiàn)(自然存在或拉米夫定治療后出現(xiàn)的少量變異株)由于不存在藥物的選擇壓力而在肝細(xì)胞中迅速復(fù)制, 從而引起HBV DNA突發(fā). 近年來, 隨著對YMDD變異株研究的進(jìn)一步深入, 發(fā)現(xiàn)并不是所有YMDD變異株均存在復(fù)制缺陷, HBV YMDD變異株的復(fù)制能力并非均減弱[27]. 最近發(fā)現(xiàn)YMDD變異伴“a”決定簇內(nèi)變異時, 患者可出現(xiàn)病情惡化, 體外研究結(jié)果顯示, 這種聯(lián)合變異可使病毒的復(fù)制能力明顯增強, 與以往的研究結(jié)果不一致. 還有研究也提示, HBV DNA多聚酶rtLl80M (B區(qū))變異可補償HBV YMDD變異株的復(fù)制缺陷, 使HBV的復(fù)制增強. 其他學(xué)者的研究也證實, YMDD基序之外的變異可補償YMDD變異株的復(fù)制缺陷. 臨床研究也發(fā)現(xiàn)某些YMDD變異株可能具有較強的復(fù)制能力. 有人報道, 在臨床上已發(fā)現(xiàn)YMDD變異株引起的急性HBV感染. 并且對YMDD變異株的消長狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測發(fā)現(xiàn), 停用拉米夫定之后, 體內(nèi)的YMDD變異株可存在數(shù)月之久. YMDD變異株借助YMDD基序之外的變異補償HBV復(fù)制缺陷的假設(shè), 可以解釋臨床上有些患者出現(xiàn)變異后高于治療前水平的HBV DNA滴度. 這也可能是某些YMDD變異者病情加重的原因之一.

　　2.2 對病情的影響 YMDD突變后患者的臨床表現(xiàn)形式多樣, 最初表現(xiàn)為血清HBV DNA水平下降或陰轉(zhuǎn)后繼續(xù)治療時陽轉(zhuǎn)或明顯上升, 部分患者可無臨床癥狀、ALT正常, 類似免疫耐受; 也有部分患者出現(xiàn)肝炎發(fā)作, ALT水平升高. 對臨床表現(xiàn)輕微的患者繼續(xù)拉米夫定治療, 大多數(shù)仍可獲益. 但也有少數(shù)患者, 特別是肝臟儲備下降的患者如肝硬化及肝功能失代償者, 在繼續(xù)拉米夫定治療后病情急性加重[28-29], 應(yīng)引起臨床重視. 拉米夫定相關(guān)變異株引起病情急性加重的機制尚不清楚, 肝臟病變基礎(chǔ)和肝功能的代償能力可能是重要的影響因素, 應(yīng)進(jìn)一步加強對臨床表現(xiàn)及治療的研究[30]. 關(guān)于突變株出現(xiàn)后患者肝功能的改變, 目前的結(jié)論不盡相同. 有學(xué)者認(rèn)為, 出現(xiàn)YMDD基序的變異, 伴有對拉米夫定耐藥, 表現(xiàn)為HBV DNA滴度升高, 伴有肝酶升高, 但升高的水平低于治療前的水平, 肝組織病理結(jié)果與變異株出現(xiàn)前沒有惡化, 與沒有抗藥性的患者的組織學(xué)表現(xiàn)相似[31]. 目前認(rèn)為, 發(fā)生YMDD變異患者繼續(xù)使用拉米夫定治療, 其肝組織學(xué)的改善優(yōu)于安慰劑組. 所以, 變異株出現(xiàn)后仍可繼續(xù)治療. 因為停止治療后, 野毒株將重新成為優(yōu)勢株, 而變異株的DNA復(fù)制水平低于野毒株, 肝功能的損害也較野毒株輕[32-33]. 體外研究指出, YMDD變異株并不像野毒株那樣有效地進(jìn)行復(fù)制.

　　3 預(yù)防和處理

　　3.1 嚴(yán)格拉米夫定治療的適應(yīng)證 拉米夫定不能濫用, 必須選擇適應(yīng)證. 基礎(chǔ)病毒水平過高或免疫耐受的患者常需長期應(yīng)用拉米夫定, 耐藥變異的發(fā)生率很高[34]mo后, 需密切觀察, . 選用拉米夫定治療6 mo以內(nèi)反復(fù)增高, mo, 或6 定期檢測YMDD和病毒定量. 目前認(rèn)可的拉米夫定治療的適應(yīng)證為: (1)ALT≥2×正常值上限(ULN), 并持續(xù)增高至少1 建議實施治療; (2)ALT水平在1-2×ULN之間, 建議根據(jù)患者具體情況(如肝活檢結(jié)果等), 權(quán)衡利弊, 決定是否實施治療; a; (3)可以應(yīng)用于失代償期肝硬化合并HBV DNA陽性或/和HBeAg陽性的患者; (4)有抗病毒指征的慢性乙型肝炎患者, 療程至少1 (5)針對不同的患者應(yīng)該采用個體化療法. YMDD發(fā)生變異后仍繼續(xù)用拉米夫定治療的患者, 如發(fā)現(xiàn)血清病毒水平明顯增高和/或血清轉(zhuǎn)氨酶增高, 應(yīng)停藥改用其他治療. 發(fā)現(xiàn)YMDD后停藥的患者, 需密切觀察, 警惕停藥后病情急性加重. 出現(xiàn)耐藥突變后伴有病情加重時, 建議在加強綜合治療措施同時, 采取積極有效的方法, 如改用或聯(lián)合阿德福韋治療[35]mo后開始檢測, 如野毒株轉(zhuǎn)換, 可再用拉米夫定治療, 但可能再次變異, 且發(fā)生較早. . 3 一般發(fā)現(xiàn)耐藥變異后需換用其他抗病毒藥物. 野毒株轉(zhuǎn)換后重新用拉米夫定, 最好與其他藥物聯(lián)合治療[36].

　　3.2 拉米夫定聯(lián)合用藥的問題 由于目前抗HBV的藥物療效有限, 聯(lián)合治療和個體化治療一直是大家關(guān)注的問題, 很多學(xué)者都認(rèn)為今后的發(fā)展方向為聯(lián)合治療, 但目前美國、歐洲、亞太肝病專家3個國際會議的共識建議中均未提到聯(lián)合治療的方案, 主要由于目前臨床研究資料還不夠充分. 目前較多報道為干擾素和拉米夫定聯(lián)合應(yīng)用, 尚未獲得肯定結(jié)論. 盡管現(xiàn)有資料尚不能反映聯(lián)合治療的優(yōu)勢, 但不同作用機制的藥物聯(lián)合治療仍是今后研究的方向. 為何抗HBV的藥物聯(lián)合治療不像其他疾病那樣獲得良好療效? 也是日后研究的重點[37]. 個體化治療將是決定治療效果的關(guān)鍵, 包括不同基因型對干擾素治療應(yīng)答有差異, 免疫狀態(tài)和治療的關(guān)系等. 拉米夫定聯(lián)合其他作用位點不同的核苷類似物[38]、免疫調(diào)節(jié)劑[39]、干擾素[40]等的治療方案尚在探索之中. 理論上聯(lián)合用藥能降低耐藥性產(chǎn)生, 有更高的反應(yīng)率, 能使體內(nèi)病毒量下降更多, 但實際作用還有待廣泛的臨床研究證實. Leung et al[41]a內(nèi)64%的患者HBeAg陰轉(zhuǎn), ALT復(fù)常率100%, 聯(lián)合拉米夫定、泛昔洛韋、胸腺素治療CHB, 1 治療后所有患者血清HBV DNA均陰轉(zhuǎn). 值得指出的是, 體外實驗中, 2'''''''', 3''''''''-二脫氧胞苷、脫氧胞苷以及2'''''''', 3''''''''-二脫氫-2'''''''', 3''''''''-二脫氧胸苷可明顯抑制拉米夫定的磷酸化過程[42], 故聯(lián)合應(yīng)用核苷類似物時應(yīng)考慮到藥物間的相互作用. Rigopoulou et al[43]應(yīng)用拉米夫定聯(lián)合IL-12治療, 觀察患者體內(nèi)病毒學(xué)反應(yīng)和免疫應(yīng)答也收到了良好的效果. 我們在相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)劑胸腺肽α1能夠改善患者的免疫功能, 其與拉米夫定、干擾素或其他抗病毒藥物的聯(lián)合使用都表現(xiàn)出良好的治療效果[44].

　　總之, 遺傳和變異是生物界普遍現(xiàn)象, 病毒結(jié)構(gòu)簡單和增殖速度較快使其更易變異, 這種變異可自發(fā)或誘導(dǎo), 對外界壓力干預(yù)產(chǎn)生反抗, 結(jié)果是耐藥生存. 因此, 拉米夫定治療CHB出現(xiàn)耐藥性是完全符合客觀規(guī)律的. 最近有研究表明, 在15%-25%未曾用過拉米夫定治療的CHB患者的血液中存在YMDD變異株, 實際上YMDD變異出現(xiàn)并非應(yīng)用拉米夫定所特有[45]. 拉米夫定自上市以來雖然其耐藥性成為其繼續(xù)推廣應(yīng)用的一個問題, 但這個問題正在不斷地得到解決. 拉米夫定治療CHB的療效和HBV變異株的出現(xiàn)是目前臨床關(guān)注的熱點[46]. 拉米夫定長期治療耐藥毒株產(chǎn)生幾率增加和短期治療大多數(shù)患者回復(fù)到治療前狀態(tài), 是難以解決的矛盾. YMDD變異對病毒復(fù)制、ALT反跳和臨床癥狀的影響, 報道結(jié)果不盡相同, 其原因可能與人體免疫功能狀態(tài)及病毒復(fù)制水平相關(guān). 而停藥后出現(xiàn)的病情急性加重也提示, 應(yīng)加強對拉米夫定治療的審慎選擇. 總之, 拉米夫定是CHB的重要治療措施, 但也存在YMDD變異致耐藥性的產(chǎn)生. 治療中采用其他藥物替代或聯(lián)合其他藥物治療, 可避免耐藥突變的產(chǎn)生, 但迄今尚無確切有效的HBV耐藥性變異株的治療方法[47-48].  有關(guān)拉米夫定耐藥性的分子生物學(xué)研究和應(yīng)用拉米夫定的聯(lián)合治療方案及療效尚待進(jìn)一步探索.

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