α干擾素及其它制劑干預肝癌轉移復發和腫瘤生長的實驗研究

 

    原發性肝癌是亞、非洲最常見的惡性腫瘤之一，年平均發病約為30人。手術切除是重要的治療手段，由于木后較高的復發率和大多數肝癌病人診斷時已不能手術，肝癌的預后差。肝癌對化療不敏感，目前對肝癌轉移復發有抑制作用的實驗性干預藥物難以上臨床。肝癌轉移是多步驟的過程，針對肝癌轉移復發分子機理的生物治療藥物是干預的重要方向，肝癌是典型的多血管腫瘤，其復發與腫瘤血管形成有關，抗腫瘤血管形成治療對肝癌轉移復發的干預有特殊意義。尋找有效的抗肝癌轉移復發的藥物，對一些已在臨床應用的藥物探索其潛在的抗轉移作用，篩選出具有實際應用價值者為臨床直接應用，將極大地改善肝癌病人的預
后。并通過對其作用機理的研究推動肝癌復發機理的研究。

一、標化實驗動物模型（LCI-D20）
    裸鼠人肝癌轉移模型LCI-D20是我所首次建立的原位移植人肝癌高轉移模型，該瘤株在宿主體內展示100%的移植生長和轉移，能在人體外模擬人肝癌轉移的自然過程，是一株可供研究實驗性干預人肝癌轉移復發的理想模型。在此基礎上，觀察分別于原位移植LCI-D20腫瘤后不同時間根治性切除移植瘤后及未切腫瘤的荷瘤裸鼠的轉移復發率和生存時間。結果發現：裸鼠種植LCI-D20腫瘤組織后第3周可出現肝內播散，肺轉移率達70%，平均生存期45±天。于移植后7-14天切除肝移植瘤，術后處死時間延至5周，腫瘤轉移復發率為100%，移植后11天切除肝移植瘤裸鼠平均生存期67±4天。從而確定本研究采用的動物模型一般分兩組，
一組為接種后24小時即用藥，觀測藥物對肝移植瘤生長的抑制，另一組為移植后7-14天切除肝移植瘤，24小時后給藥，用藥4-5周，觀察其對轉移復發的療效。

二、干預不同環節的藥物對肝癌轉移復發和腫瘤生長作用的初步探索
    肝癌的轉移與腫瘤及癌周組織表達雌雄激素受體有關，但臨床肝癌的激素治療效果不肯定。肝癌是典型的多血管腫瘤，肝癌組織中微血管密度與肝癌術后的轉移復發有關。Droloxifene和2-羥基氟他胺分別阻斷雌、雄激素受體與相應配體結合。維甲酸通過影響腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡而起抗腫瘤作用，也有抑制腫瘤血管形成的作用。α干擾素具有影響細胞增殖、分化、免疫功能的作用，也具有抗腫瘤血管形成的活性。本實驗通過裸鼠人肝癌轉移模型LCI-D20進行體內抑制腫瘤轉移復發及腫瘤生長實驗，以探索有潛在阻斷肝癌轉移可能的已在臨床應用的Droloxifene、2-羥基氟他胺(futamine)、全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)、以干擾素（interferon α，IFN-α-1b，商品名Sinogen)對肝癌轉移復發和腫瘤生長的作用。發現Droloxifene，2-羥基氟他胺，ATRA對根治性切除術后肝癌的轉移復發及腫瘤生長無抑制作用。在早期(7天)切除后大劑量IFN-α(3×10⁷ U/kg/天)治療組肝內復發率、肝內復發瘤大小、肝內播散灶、肺轉移率、肺轉移灶數目分別為 16.7%，3±mm³，0個，0%和0個；而對照組分別為100%，3224±1297mm³，4±1個，100%，及 6+2個。兩者比較，差別有統計學意義(P＜0.01)。結果初步提示早期應用大劑量IFN-α對肝癌轉移復發有抑制作用。

一、LCI-D20裸鼠體內應用IFN-α對肝癌轉移復發和腫瘤生長的抑制
    為探索IFN-α對肝癌生長、復發的作用及其劑量效應關系。采用不同劑量IFN-α通過棵鼠人肝癌轉移模型LCI-D20進行體內實驗。共種植105只。LCI-D20模型，其中64只裸鼠作為預防組于種植后第11天根治性切除移植瘤。于切除后第2天開始皮下注射不同劑量的IFN-α連續用藥35天，于37天處死棵鼠，檢測IFN-α對肝癌轉移復發的預防作用。剩余的41只荷瘤裸鼠于種植后第2天開始給予不同劑量IFN-α治療。治療35天，于37天后每組剩余5只棵鼠繼續治療至死亡以觀察IFN-α對生存期的影響，其余棵鼠處死，檢測IFN-α對較大腫瘤負荷的治療作用。結果裸鼠肝內移植括大小對照組為8475±2636mm³，IFN-α1.5×10⁷ U/kg治療組為769±287mm³，與對照組比較差別有統計學意義(P＜0.001)；3×10⁷ U/kg IFN-α治療組為13±9mm³ ，與對照組比較差別有統計學意義(p＜0.001)。裸鼠肺轉移率對照組為100%(5/5)，IFN-α3×10⁷ U/kg治療組為0%，與對照組比較差別有統計學意義(p＜0.05)。IFN-α可延長荷瘤裸鼠生存時間。對照組平均生存期為45±4天，而IFN-α治療1.5×10⁷ U/kg劑量組和3×10⁷ U/kg劑量組保鼠平均生再期分別為81±6天、105±24天，與對照組比較差別有統計學意義
(P<0.05）。IFN-α對根治性切除后肝癌轉移復發有抑制作用。裸鼠肺轉移率、肝內復發率、復發瘤大小對照組分別為100% 、100%、1786±538mm³。IFN-αl.5 × 107 U/kg治療組分別為0、62.5%、11±4mm³，與對照組比較差別有統計學意義(P＜0.05)；IFN-α3×10⁷ U/Kg治療組0、12.5%、0.5mm³，與對照組比較差別有統計學意義(P＜0.001)。與對照組相比IFN-αl×l0⁶ U/kg可明顯抑制肝內復發瘤生長(1786±538mm³ v260±57mm³ ，P＜0.001）。按體表面積計算相當于人5.5MU，每周3次。為臨床應用提供了參考。我們的結果顯示長期大劑量應用IFN-α可以抑制肝癌術后轉移復發和腫瘤生長，并呈劑量效應關系，為臨床特別是肝癌術后方法復發的抑制提供了依據。

二、IFN-α對皮下移植肝癌生長的抑制
    為了直接觀察IFN-α對腫瘤生長的作用，我們將LCI-D20腫瘤組織植入棵鼠背部皮下。于移植后第2天開始皮下注射IFN-α(1.5×10⁷ U/kg/天) ，連續用藥35天，對照組皮下注射相同體積生理鹽水，每5天觀察腫瘤大小。對照紅腫瘤在第35天腫瘤平均體積為6053mm³。應用l.5 × 10⁷U/kg/天劑量的IFN-α對腫瘤生長有明顯抑制，在第35天腫瘤平均體積為3308mm³ ，與對照組相比差別有統計學意義(p＜0.05）。

三、ATRA對IFN-α抑制肝癌轉移復發和腫瘤生長的協同效應
    本實驗通過裸鼠人肝癌轉移模型LCI-D20進行體內實驗，聯用不同劑量IFN-α和ATRA并和單獨應用IFN-α的療效相比較，驗證從RA對IFN－a是否有療效的協同效應。結果顯示在荷瘤裸鼠應用ATRA與不同劑量的IFN-α，治療組裸鼠腫瘤大小分別為8097±2531mm³ 、839±304mm³ 和15±7mm³；肺轉移率分別為80%、40%和0%。而單獨應用上述劑量IFN-α腫瘤大小分別為7963±3214mm³、769±287mm³和13±9mm³；肺轉移率分別為80%、40%和0%。結果與單獨應用IFN-α比較，差別無統計學意義(P＞0.05)。在根治性切除移植瘤的裸鼠應用ATRA與不同劑量的IFN-α治療組裸鼠肝內復發瘤大小為1067±756、16±9和lmm³；肺轉移率分別為90% 、0%和0%。單獨應用上述劑量的IFN-α肝內復發瘤大小分別為1345±559 mm³、11±4mm³、lmm³；肺轉移率為75%、0%和0%。二者比較差別無統計學意義(P＞0.05)。提示ATRA對IFN-α抑制肝癌轉移復發和腫瘤生長無協同作用。

四、體內外檢測IFN-α抑制肝癌血管形成的作用
    體外檢測IFN-α對肝癌細胞株增殖的作用以及對人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)增殖和移動的影響。通過裸鼠角膜微囊移植模型檢測IFN-α對裸鼠角膜形成新生血管的影響，以探討IFN-α作用機理。結果表明IFN-α在濃度為1000U/ml對BEL-7402細胞增殖的抑制率＞5%，而其它肝癌細胞株包括MHCC97的增殖幾乎不受IFN-α的影響。IFN-α可顯著抑制HUVECs增殖，其ED₅₀為50U/ml，并呈劑量效應關系。IFN-α濃度達100U/ml即顯著抑制HUVECs的移動。通過肝癌裸鼠角膜微囊移植模型直觀發現應用IFN-α使裸鼠角膜形成新生血管被明顯抑制，在第ZI天，治療組角膜新生血管積分為16±4，而對照組為27±6。

一、IFN-α治療后糠見血清血管內度生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)水平的變化
    檢測切除移植瘤后應用IFN-α（l.5×10⁷ U/kg/天和3×10⁷ U/kg/天）治療裸鼠血清血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroflast growth factor，bFGF）水平，并與單純切除移植瘤裸鼠及未切瘤的荷瘤棵鼠血清中VEGF和bFGF的水平比較。發現荷瘤者、單純切瘤者、腫瘤切除后應用IFN-α1.5×10⁷ U/kg/天和3×10⁷ U/kg/天裸鼠血清VEGF含量分別為197.5±67.8pg/mL，265±154.7pg/mL，53.3±9.9pg/mL和65.2±17.9pg/mL。切除腫瘤后經IFN-α治療者，其VEGF水平顯著低于切除而未經治療者，也低于未切除的對照組(P<0.05)。而IFN-α治療對bFGF水平則無明顯影響，治療與非治療者相仿。證實IFN-α可抑制肝癌細胞VEGF的產生。

二、IFN-α對血管內度生長因子(VEGF)和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表達的影響
    一氧化氮合酶活性的增高與VEGF及腫瘤血管形成關系密切，一氧化氮在VEGF誘導新生血管形成過程的每一步驟均起重要作用。應用RT-PCR方法分析根治性切除肝移植瘤后IFN-α治療組（1.5×10⁷ U/kg)和對照組復發瘤組織血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達水平結果顯示，對照組腫瘤組織VEGF表達水平高于治療組(P<0.05)。iNOSmRNA經PT-PCR擴增后，對照組腫瘤組織iNOSmRNA表達水平高于治療組(P<0.05)。

三、IFN-α治療后肝癌組織VEGF、iNOS表達及微血管密度(MVD)的變化
    應用免疫組化方法分別檢測到不同劑量IFN-α(1.5×10⁷ U/kg/天，n＝9; 3 ×10⁷ U/kg/天，n＝10連續35治療及給予相同體積生理鹽水的LCI－D20裸鼠腫瘤組織標本中iNOS和VEGF均為細胞漿著色，在19例治療組肝癌組織中分別有36.8%（7/19）表達iNOS和VEGF；在13例對照組肝癌組織中分別有69.2% (9/13) 表達iNOS，76.9%(10/13) 表達VEGF，治療前后VEGF表達差異有統計意義(P＜0.05）。1.5×10⁷ U/kg/天、3×IO⁷U/kg/天治療組肝癌組織腫瘤微血管密度（microvessel density，MVD）平均分別為66±5/每高倍視野，21±9/每高倍視野，而對照組腫瘤微血管密度平均為114±18/每高倍視野(P＜0.01）。結果提示IFN-α可以抑制VEGF的產生進而阻斷肝癌血管形成。應用IFN-α可抑制VEGF及iNOS的核酸表達。初步表明IFN-α主要通過抑制VEGF、iNOS進而阻斷肝癌形成新生血管。也提示VEGF及iNOS在促進肝癌的腫瘤血管形成中起一定的作用。

結論
    1．本實驗證實拮抗雌雄激素受體藥物Droloxifene、2-羥基氟他胺以及分化誘導劑全反式維甲酸對肝癌腫瘤生長及根治性切除術后轉移復發無抑制作用。
    2．大劑量長療程應用IFN-α治療能夠抑制肝癌的轉移復發和腫瘤生長，其抑制術后復發的作用較抑制未經切除的移植瘤的作用更為明顯。其效應是劑量依賴性。證實應用1×10⁶ U/kg/天劑量IFN-α可顯著抑制根治性術后肝內復發瘤的生長，相當于人5.5MU，每周3次。
    3．IFN-α的作用機理為阻斷肝癌的腫瘤血管形成。
    4．IFN-α阻斷肝癌腫瘤血管形成主要通過抑制VEGF而非bFGF的產生。一氧化氮在介導肝癌血管形成中與VEGF有協同作用。