α干擾素及其它制劑干預(yù)肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究

 

 

 

原發(fā)性肝癌是亞、非洲最常見的惡性腫瘤之一，年平均發(fā)病約為30人。手術(shù)切除是重要的治療手段，由于木后較高的復(fù)發(fā)率和大多數(shù)肝癌病人診斷時(shí)已不能手術(shù)，肝癌的預(yù)后差。肝癌對(duì)化療不敏感，目前對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有抑制作用的實(shí)驗(yàn)性干預(yù)藥物難以上臨床。肝癌轉(zhuǎn)移是多步驟的過程，針對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)分子機(jī)理的生物治療藥物是干預(yù)的重要方向，肝癌是典型的多血管腫瘤，其復(fù)發(fā)與腫瘤血管形成有關(guān)，抗腫瘤血管形成治療對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的干預(yù)有特殊意義。尋找有效的抗肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的藥物，對(duì)一些已在臨床應(yīng)用的藥物探索其潛在的抗轉(zhuǎn)移作用，篩選出具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值者為臨床直接應(yīng)用，將極大地改善肝癌病人的預(yù)
后。并通過對(duì)其作用機(jī)理的研究推動(dòng)肝癌復(fù)發(fā)機(jī)理的研究。

 

一、標(biāo)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型（LCI-D20）
    裸鼠人肝癌轉(zhuǎn)移模型LCI-D20是我所首次建立的原位移植人肝癌高轉(zhuǎn)移模型，該瘤株在宿主體內(nèi)展示100%的移植生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，能在人體外模擬人肝癌轉(zhuǎn)移的自然過程，是一株可供研究實(shí)驗(yàn)性干預(yù)人肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的理想模型。在此基礎(chǔ)上，觀察分別于原位移植LCI-D20腫瘤后不同時(shí)間根治性切除移植瘤后及未切腫瘤的荷瘤裸鼠的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率和生存時(shí)間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：裸鼠種植LCI-D20腫瘤組織后第3周可出現(xiàn)肝內(nèi)播散，肺轉(zhuǎn)移率達(dá)70%，平均生存期45±天。于移植后7-14天切除肝移植瘤，術(shù)后處死時(shí)間延至5周，腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率為100%，移植后11天切除肝移植瘤裸鼠平均生存期67±4天。從而確定本研究采用的動(dòng)物模型一般分兩組，
一組為接種后24小時(shí)即用藥，觀測(cè)藥物對(duì)肝移植瘤生長(zhǎng)的抑制，另一組為移植后7-14天切除肝移植瘤，24小時(shí)后給藥，用藥4-5周，觀察其對(duì)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的療效。

 

二、干預(yù)不同環(huán)節(jié)的藥物對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和腫瘤生長(zhǎng)作用的初步探索
    肝癌的轉(zhuǎn)移與腫瘤及癌周組織表達(dá)雌雄激素受體有關(guān)，但臨床肝癌的激素治療效果不肯定。肝癌是典型的多血管腫瘤，肝癌組織中微血管密度與肝癌術(shù)后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有關(guān)。Droloxifene和2-羥基氟他胺分別阻斷雌、雄激素受體與相應(yīng)配體結(jié)合。維甲酸通過影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡而起抗腫瘤作用，也有抑制腫瘤血管形成的作用。α干擾素具有影響細(xì)胞增殖、分化、免疫功能的作用，也具有抗腫瘤血管形成的活性。本實(shí)驗(yàn)通過裸鼠人肝癌轉(zhuǎn)移模型LCI-D20進(jìn)行體內(nèi)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，以探索有潛在阻斷肝癌轉(zhuǎn)移可能的已在臨床應(yīng)用的Droloxifene、2-羥基氟他胺(futamine)、全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)、以干擾素（interferon α，IFN-α-1b，商品名Sinogen)對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和腫瘤生長(zhǎng)的作用。發(fā)現(xiàn)Droloxifene，2-羥基氟他胺，ATRA對(duì)根治性切除術(shù)后肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及腫瘤生長(zhǎng)無抑制作用。在早期(7天)切除后大劑量IFN-α(3×10⁷ U/kg/天)治療組肝內(nèi)復(fù)發(fā)率、肝內(nèi)復(fù)發(fā)瘤大小、肝內(nèi)播散灶、肺轉(zhuǎn)移率、肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目分別為 16.7%，3±m(xù)m³，0個(gè)，0%和0個(gè)；而對(duì)照組分別為100%，3224±1297mm³，4±1個(gè)，100%，及 6+2個(gè)。兩者比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)果初步提示早期應(yīng)用大劑量IFN-α對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有抑制作用。

 

一、LCI-D20裸鼠體內(nèi)應(yīng)用IFN-α對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和腫瘤生長(zhǎng)的抑制
    為探索IFN-α對(duì)肝癌生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)的作用及其劑量效應(yīng)關(guān)系。采用不同劑量IFN-α通過棵鼠人肝癌轉(zhuǎn)移模型LCI-D20進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。共種植105只。LCI-D20模型，其中64只裸鼠作為預(yù)防組于種植后第11天根治性切除移植瘤。于切除后第2天開始皮下注射不同劑量的IFN-α連續(xù)用藥35天，于37天處死棵鼠，檢測(cè)IFN-α對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的預(yù)防作用。剩余的41只荷瘤裸鼠于種植后第2天開始給予不同劑量IFN-α治療。治療35天，于37天后每組剩余5只棵鼠繼續(xù)治療至死亡以觀察IFN-α對(duì)生存期的影響，其余棵鼠處死，檢測(cè)IFN-α對(duì)較大腫瘤負(fù)荷的治療作用。結(jié)果裸鼠肝內(nèi)移植括大小對(duì)照組為8475±2636mm³，IFN-α1.5×10⁷ U/kg治療組為769±287mm³，與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)；3×10⁷ U/kg IFN-α治療組為13±9mm³ ，與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。裸鼠肺轉(zhuǎn)移率對(duì)照組為100%(5/5)，IFN-α3×10⁷ U/kg治療組為0%，與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。IFN-α可延長(zhǎng)荷瘤裸鼠生存時(shí)間。對(duì)照組平均生存期為45±4天，而IFN-α治療1.5×10⁷ U/kg劑量組和3×10⁷ U/kg劑量組保鼠平均生再期分別為81±6天、105±24天，與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05）。IFN-α對(duì)根治性切除后肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有抑制作用。裸鼠肺轉(zhuǎn)移率、肝內(nèi)復(fù)發(fā)率、復(fù)發(fā)瘤大小對(duì)照組分別為100% 、100%、1786±538mm³。IFN-αl.5 × 107 U/kg治療組分別為0、62.5%、11±4mm³，與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；IFN-α3×10⁷ U/Kg治療組0、12.5%、0.5mm³，與對(duì)照組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。與對(duì)照組相比IFN-αl×l0⁶ U/kg可明顯抑制肝內(nèi)復(fù)發(fā)瘤生長(zhǎng)(1786±538mm³ v260±57mm³ ，P＜0.001）。按體表面積計(jì)算相當(dāng)于人5.5MU，每周3次。為臨床應(yīng)用提供了參考。我們的結(jié)果顯示長(zhǎng)期大劑量應(yīng)用IFN-α可以抑制肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和腫瘤生長(zhǎng)，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系，為臨床特別是肝癌術(shù)后方法復(fù)發(fā)的抑制提供了依據(jù)。

 

二、IFN-α對(duì)皮下移植肝癌生長(zhǎng)的抑制
    為了直接觀察IFN-α對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用，我們將LCI-D20腫瘤組織植入棵鼠背部皮下。于移植后第2天開始皮下注射IFN-α(1.5×10⁷ U/kg/天) ，連續(xù)用藥35天，對(duì)照組皮下注射相同體積生理鹽水，每5天觀察腫瘤大小。對(duì)照紅腫瘤在第35天腫瘤平均體積為6053mm³。應(yīng)用l.5 × 10⁷U/kg/天劑量的IFN-α對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有明顯抑制，在第35天腫瘤平均體積為3308mm³ ，與對(duì)照組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05＝。

 

三、ATRA對(duì)IFN-α抑制肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和腫瘤生長(zhǎng)的協(xié)同效應(yīng)
    本實(shí)驗(yàn)通過裸鼠人肝癌轉(zhuǎn)移模型LCI-D20進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，聯(lián)用不同劑量IFN-α和ATRA并和單獨(dú)應(yīng)用IFN-α的療效相比較，驗(yàn)證從RA對(duì)IFN－a是否有療效的協(xié)同效應(yīng)。結(jié)果顯示在荷瘤裸鼠應(yīng)用ATRA與不同劑量的IFN-α，治療組裸鼠腫瘤大小分別為8097±2531mm³ 、839±304mm³ 和15±7mm³；肺轉(zhuǎn)移率分別為80%、40%和0%。而單獨(dú)應(yīng)用上述劑量IFN-α腫瘤大小分別為7963±3214mm³、769±287mm³和13±9mm³；肺轉(zhuǎn)移率分別為80%、40%和0%。結(jié)果與單獨(dú)應(yīng)用IFN-α比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在根治性切除移植瘤的裸鼠應(yīng)用ATRA與不同劑量的IFN-α治療組裸鼠肝內(nèi)復(fù)發(fā)瘤大小為1067±756、16±9和lmm³；肺轉(zhuǎn)移率分別為90% 、0%和0%。單獨(dú)應(yīng)用上述劑量的IFN-α肝內(nèi)復(fù)發(fā)瘤大小分別為1345±559 mm³、11±4mm³、lmm³；肺轉(zhuǎn)移率為75%、0%和0%。二者比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示ATRA對(duì)IFN-α抑制肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和腫瘤生長(zhǎng)無協(xié)同作用。

 

四、體內(nèi)外檢測(cè)IFN-α抑制肝癌血管形成的作用
    體外檢測(cè)IFN-α對(duì)肝癌細(xì)胞株增殖的作用以及對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)增殖和移動(dòng)的影響。通過裸鼠角膜微囊移植模型檢測(cè)IFN-α對(duì)裸鼠角膜形成新生血管的影響，以探討IFN-α作用機(jī)理。結(jié)果表明IFN-α在濃度為1000U/ml對(duì)BEL-7402細(xì)胞增殖的抑制率＞5%，而其它肝癌細(xì)胞株包括MHCC97的增殖幾乎不受IFN-α的影響。IFN-α可顯著抑制HUVECs增殖，其ED₅₀為50U/ml，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系。IFN-α濃度達(dá)100U/ml即顯著抑制HUVECs的移動(dòng)。通過肝癌裸鼠角膜微囊移植模型直觀發(fā)現(xiàn)應(yīng)用IFN-α使裸鼠角膜形成新生血管被明顯抑制，在第ZI天，治療組角膜新生血管積分為16±4，而對(duì)照組為27±6。

 

 

一、IFN-α治療后糠見血清血管內(nèi)度生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)水平的變化
    檢測(cè)切除移植瘤后應(yīng)用IFN-α（l.5×10⁷ U/kg/天和3×10⁷ U/kg/天）治療裸鼠血清血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroflast growth factor，bFGF）水平，并與單純切除移植瘤裸鼠及未切瘤的荷瘤棵鼠血清中VEGF和bFGF的水平比較。發(fā)現(xiàn)荷瘤者、單純切瘤者、腫瘤切除后應(yīng)用IFN-α1.5×10⁷ U/kg/天和3×10⁷ U/kg/天裸鼠血清VEGF含量分別為197.5±67.8pg/mL，265±154.7pg/mL，53.3±9.9pg/mL和65.2±17.9pg/mL。切除腫瘤后經(jīng)IFN-α治療者，其VEGF水平顯著低于切除而未經(jīng)治療者，也低于未切除的對(duì)照組(P<0.05)。而IFN-α治療對(duì)bFGF水平則無明顯影響，治療與非治療者相仿。證實(shí)IFN-α可抑制肝癌細(xì)胞VEGF的產(chǎn)生。

 

二、IFN-α對(duì)血管內(nèi)度生長(zhǎng)因子(VEGF)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA表達(dá)的影響
    一氧化氮合酶活性的增高與VEGF及腫瘤血管形成關(guān)系密切，一氧化氮在VEGF誘導(dǎo)新生血管形成過程的每一步驟均起重要作用。應(yīng)用RT-PCR方法分析根治性切除肝移植瘤后IFN-α治療組（1.5×10⁷ U/kg)和對(duì)照組復(fù)發(fā)瘤組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達(dá)水平結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤組織VEGF表達(dá)水平高于治療組(P<0.05)。iNOSmRNA經(jīng)PT-PCR擴(kuò)增后，對(duì)照組腫瘤組織iNOSmRNA表達(dá)水平高于治療組(P<0.05)。

 

三、IFN-α治療后肝癌組織VEGF、iNOS表達(dá)及微血管密度(MVD)的變化
    應(yīng)用免疫組化方法分別檢測(cè)到不同劑量IFN-α(1.5×10⁷ U/kg/天，n＝9; 3 ×10⁷ U/kg/天，n＝10連續(xù)35治療及給予相同體積生理鹽水的LCI－D20裸鼠腫瘤組織標(biāo)本中iNOS和VEGF均為細(xì)胞漿著色，在19例治療組肝癌組織中分別有36.8%（7/19）表達(dá)iNOS和VEGF；在13例對(duì)照組肝癌組織中分別有69.2% (9/13) 表達(dá)iNOS，76.9%(10/13) 表達(dá)VEGF，治療前后VEGF表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05）。1.5×10⁷ U/kg/天、3×IO⁷U/kg/天治療組肝癌組織腫瘤微血管密度（microvessel density，MVD）平均分別為66±5/每高倍視野，21±9/每高倍視野，而對(duì)照組腫瘤微血管密度平均為114±18/每高倍視野(P＜0.01）。結(jié)果提示IFN-α可以抑制VEGF的產(chǎn)生進(jìn)而阻斷肝癌血管形成。應(yīng)用IFN-α可抑制VEGF及iNOS的核酸表達(dá)。初步表明IFN-α主要通過抑制VEGF、iNOS進(jìn)而阻斷肝癌形成新生血管。也提示VEGF及iNOS在促進(jìn)肝癌的腫瘤血管形成中起一定的作用。

 

結(jié)論
    1．本實(shí)驗(yàn)證實(shí)拮抗雌雄激素受體藥物Droloxifene、2-羥基氟他胺以及分化誘導(dǎo)劑全反式維甲酸對(duì)肝癌腫瘤生長(zhǎng)及根治性切除術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)無抑制作用。
    2．大劑量長(zhǎng)療程應(yīng)用IFN-α治療能夠抑制肝癌的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和腫瘤生長(zhǎng)，其抑制術(shù)后復(fù)發(fā)的作用較抑制未經(jīng)切除的移植瘤的作用更為明顯。其效應(yīng)是劑量依賴性。證實(shí)應(yīng)用1×10⁶ U/kg/天劑量IFN-α可顯著抑制根治性術(shù)后肝內(nèi)復(fù)發(fā)瘤的生長(zhǎng)，相當(dāng)于人5.5MU，每周3次。
    3．IFN-α的作用機(jī)理為阻斷肝癌的腫瘤血管形成。
    4．IFN-α阻斷肝癌腫瘤血管形成主要通過抑制VEGF而非bFGF的產(chǎn)生。一氧化氮在介導(dǎo)肝癌血管形成中與VEGF有協(xié)同作用