硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液的制備及其性質考察

    【摘要】目的：制備硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液，并對其性質進行考察。方法：以注射用大豆油和注射用中鏈脂肪酸三酰甘油為混合油相，以蛋黃卵磷脂、泊洛沙姆188和聚山梨酯-80為復合乳化劑，采用高壓均質法制備硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液，通過粒度和粒度分布、Zeta 電位、pH值、滲透壓和含量測定以及穩定性考察等對其性質進行研究。結果：制備的乳劑外觀為乳白色，略帶藍色乳光。3批樣品的粒徑分別為（158±22) 、（160±22）和( 161±33）nm，平均Zeta 電位為（-37.70±0.79) mV，平均pH 值為(7.51±0.03) ，平均滲透壓為( 279.33 ± 0.58) mmol•kg-1，平均含量為( 99.19±1.68) %，在( 6±2) 和（25±2）℃條件下放置6個月穩定。結論：制備工藝可行，制劑理化性質穩定，符合靜脈注射要求。 

    硫酸氫氯吡格雷（clopidogrel bisulfate，CLB）為二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）受體抑制劑，能選擇性地抑制ADP 與血小板受體的結合，進而抑制ADP與糖蛋白Ⅱb/Ⅲa復合物的激活，從而抑制血小板的聚集。臨床上主要用于治療不穩定心絞痛、急性腦梗死、急性缺血性腦卒中、急性心梗死、以及短暫性缺血等病癥。目前CLB在臨床應用上只有口服制劑。由于CLB在中性pH 中幾乎不溶于水，其溶解度具有很強的pH依賴性，且在水溶液中不穩定，易降解，因此，制備其注射用制劑有一定困難。目前，多采用增溶劑增加其溶解度或者凍干等方法研究其靜脈給藥制劑。

    亞微乳（submicron emulsion）是一種主要以植物油為油相，以磷脂為乳化劑的O/W型乳劑。亞微乳的粒徑在100~1000 nm之間，外觀不透明，呈渾濁或乳狀，屬于熱力學不穩定體系。亞微乳可供靜脈注射用，是脂溶性藥物的良好載體，不僅具有增加藥物穩定性、減輕不良反應、靶向釋藥作用、易于實現工業化等特點，還能提供適當的能量和必需脂肪酸，現已廣泛應用于臨床中。
本研究采用高壓均質法制備了硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液，并對其粒度和粒度分布、Zeta 電位、pH值、滲透壓和含量以及穩定性進行了考察，旨在為CLB用于注射劑的研究提供參考。

    儀器與試藥 
    B25實驗室高剪切分散乳化機（上海貝而特機電設備科技有限公司）；AH100D高壓均質機（ATS Engineering Inc. ）；PF-101S 集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司醫藥設備廠）；AR1140 電子分析天平（Ohaus Crop. Pine Brook，NJ，USA）；PHS-3CW 酸度計（上海理達儀器廠）；Coulter LS230 激光粒度分析儀（Bekman Coulter Co.Ltd.，USA）； DELSA 440 SX 電位-粒度分析儀（Bekman Coulter Co. Ltd.，USA）；Vapro@ 5520滲透壓儀（Wescor，Inc.）；高效液相色譜儀（SPD- M20A 檢測器、LC-20AT泵、LCsolution工作站，日本島津公司）； 4802H紫外可見分光光度計（Unico InstrumentsCo.，Ltd. ）；CS 120GXL型微量超速離心機（日本日立公司）； 80-2 型離心機（金壇大地自動化儀器廠）；101-2AB 型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

    硫酸氫氯吡格雷（ 北京雙鶴藥業股份有限公司，批號： CP090924）。蛋黃卵磷脂（PL-100M，日本丘比株式會社）；注射用大豆油（LCT，鐵嶺北亞藥用油有限責任公司）； 注射用中鏈脂肪酸三酰甘油（MCT，廣州漢方現代中藥研究開發有限公司）；聚山梨酯-80（Tween-80，天津市博迪化工有限公司）；泊洛沙姆188（F-68，德國BASF公司）；注射用甘油（浙江遂昌甘油廠）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

    方法與結果 
    1 硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液的處方和制備工藝考察 
    在預實驗的基礎上初步擬定處方和制備工藝，并以外觀、粒度和粒度分布對主要制備工藝參數進行優化考察。 
    1.1 制備工藝考察 
    1.1.1 初乳條件考察 本研究使用高剪切分散法制備初乳，對分散轉速、分散時間和分散溫度進行考察。 
    本研究利用蘇丹紅只溶于油，不溶于水的性質，判斷初乳中是否存在油滴，進而確定最佳初乳條件。將蘇丹紅加入初乳中，輕輕振搖，如果初乳中有油滴，蘇丹紅會溶解在油滴中，觀察到紅色油點；如果初乳中沒有油滴，則蘇丹紅不溶，觀察到紅色固狀物沉淀。以10 min內是否出現紅色油點為判斷標準，（“+”越多表示紅色油點越多，（“－”表示未觀察到紅色油點，分散時間為每次3 min，分散3次，分散溫度50~60 ℃，考察分散轉速10000~19 000 r•min-1對初乳的影響。 結果表明，隨著分散轉速的增加，初乳油滴減少，當分散轉速達16000 r•min-1以上時，初乳無油滴。但分散轉速達19000 r•min-1時，分散不足1 min即有大量（“白煙”產生，懷疑是分散轉速太高，分散過程瞬間產生大量熱量所致。因此，選擇分散轉速為16000 r•min-1。 
    分散轉速16 000 r•min-1，分散溫度50~60 ℃，考察分散時間對初乳的影響。結果表明，分散時間對初乳有一定影響，分散時間過短，不足以將油相完全包裹在水相中，有油滴產生； 分散時間過長，會在分散過程中產生大量熱量，使乳劑發生聚集，不穩定，出現油滴。因此，選擇分散時間為每次3 min，分散3次。 分散轉速16 000 r•min-1，分散時間為每次3 min，分散3次，考察分散溫度對初乳的影響，結果表明，分散溫度控制在50~60 ℃較適宜。因此，選擇分散溫度為50~60 ℃。 
    1.1.2 均質條件考察 本研究采用高壓均質法制備乳劑，在均質溫度40 ℃條件下，對均質壓力和均質次數進行考察。
選擇均質壓力分別為400，500，600，700，800，900，1000 bar，均質次數5次，制備硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液，測定其粒度和粒度分布，結果表明，隨著均質壓力的增大，乳劑粒徑減小，當壓力達到700 bar時，進一步增加壓力，粒徑無顯著性變化。因此，選擇均質壓力為700 bar。 
    均質壓力為700 bar，考察均質次數對乳劑粒度及粒度分布的影響，結果表明，均質3次后進一步增加均質次數，粒徑雖有所降低，但降低幅度減小。當均質5次以后，粒度分布隨均質次數的增加無顯著性變化。因此，選擇均質次數為5次。

     1.2 硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液的制備 
    將2.5%（w /v）注射用甘油、0.2%（w /v）F-68和0.2%（W /v）Tween-80加入到適量的注射用水中，60~70 ℃磁力攪拌，完全溶解，作為水相。將1.2%（w /v）蛋黃卵磷脂分散于7%（w /v）LCT和3%（w /v）MCT混合液中，磁力攪拌至分散均勻，60~70 ℃磁力攪拌下加入配方量的硫酸氫氯吡格雷，至完全溶解，作為油相。將油相趁熱加入到水相中，在50~60 ℃下，用高剪切分散機分散，16000 r•min-1，分散3次，每次3 min，制得初乳。加水至配方量，轉移至高壓均質機中，40 ℃，700 bar，均質5次，調節pH值至8.0，0.45 μm微孔濾膜過濾，灌裝、充氮氣，121℃滅菌15 min，即制得硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液。 
   

    2 含量測定 
    2.1 色譜條件
色譜柱：DianmonsilTMC18柱（200 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.01 mol•L-1磷酸鹽緩沖液（70∶30，磷酸調pH 值至3.0）；柱溫：室溫；檢測波長：227 nm；流速：1.0 mL•min-1；進樣量：20 μL。 
    2.2 標準曲線的繪制 
    精密稱取硫酸氫氯吡格雷標準品適量，用甲醇溶解，配制成相當于氯吡格雷250 μg•mL-1的溶液，作為儲備液；精密移取一定量的儲備液，用甲醇稀釋，分別配成1，5，25，50，100 μg•mL-1的溶液，即得氯吡格雷系列標準溶液。分別將上述標準溶液注入高效液相色譜儀中，記錄色譜圖。以峰面積（A）為縱坐標，濃度（C，μg•mL-1）為橫坐標，得回歸方程：A = 39016C －34830（r = 0.9999）。結果表明，氯吡格雷在1~100 μg•mL-1范圍內濃度與峰面積線性關系良好。精密度和穩定性的RSD 均＜2%，回收率為100.69%（n = 9）。 
    2.3 含量測定 
    精密量取硫酸氫氯吡格雷亞微乳0.1 mL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇破乳，稀釋并定容至刻線，混勻，得澄清溶液。經0.22 μm微孔濾膜過濾，進樣，記錄色譜圖，外標法計算含量。測得3批樣品的平均含量為（99.19±1.68）%。

    3 性質考察 
    3.1 性狀 
    本品為白色或類白色均勻乳狀液體，略帶藍色乳光。 
    3.2 粒度和粒度分布的測定 
    將硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液用純凈水稀釋10倍，采用Coulter LS230激光粒度分析儀測定其粒度和粒度分布。3批樣品的粒度分別為：（158±22），（160±22 ），（161±33 ）nm。 
     3.3 Zeta電位的測定 
    將硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液用純凈水稀釋200倍，采用DELSA 440 SX電位-粒度分析儀測定其Zeta電位。3批樣品的平均Zeta電位為：（-37.70±0.79）mV。 
    3.4 pH值測定 
    采用PHS-3CW酸度計測定硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液的pH值。3批樣品的平均pH值為（7.51±0.03）。 
    3.5 滲透壓測定 
    采用Vapro@ 5520滲透壓儀測定硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液的滲透壓。3批樣品的平均滲透壓為（279.33±0.58）mmol•kg-1。

    4 穩定性考察 
    4.1 離心穩定性 
    取硫酸氫氯吡格雷亞微注射液乳樣品，以4000r•min-1離心15 min，未見分層現象；然后以15000r•min-1離心10 min，未見分層現象。 
    4.2 凍融穩定性 
    凍融試驗（冷凍加熱循環實驗）用于考察分散體系對溫度變化的耐受性。 
    取硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液樣品，于-20 ℃冰箱中冷凍12 h，取出于室溫放置12 h，此為一個凍融循環。如此進行3次凍融循環，觀察其外觀并測定其粒度和粒度分布。 
    4.3 放置穩定性 
    亞微乳屬于熱力學不穩定體系，長期貯存過程中可能出現破乳、分層等現象，所以對3批硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液進行了在（6±2），（25±2）和（40±2）℃條件下放置6個月的穩定性考察，分別于0，1，2，3，6月取樣，觀察其外觀，測定其粒度和粒度分布以及含量，結果見表5~7。結果表明，在（6±2）和（25±2）℃條件下放置6個月，外觀、粒度和粒度分布以及含量均無明顯變化；在（40±2）℃條件下放置3個月，乳劑顏色變黃、略有掛壁的現象，含量下降明顯，故停止穩定性考察。

    討論 
    本實驗所制得的硫酸氫氯吡格雷亞微乳劑平均粒度在160 nm左右，平均Zeta電位在-37.70 mV左右，該粒度分布可使乳劑在較長時間內保持其物理穩定性。乳滴表面所帶負電荷可使乳滴之間產生相互排斥力，從而防止乳滴相互聚集，提高其穩定性。 
    本研究考察了硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液的凍融穩定性，經過冷凍的乳劑顏色變黃，融化后顏色恢復，未出現破乳、出油或絮凝的現象。凍融后乳劑粒徑變大，但仍在靜脈注射乳劑的安全范圍內，而且隨著凍融次數的增加，粒徑基本不再變大，粒度分布也不再變寬。說明凍融次數對其粒徑并無顯著影響，表明此制劑能經受劇烈的環境溫度變化，在一定程度上反映了此處方工藝制備的硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液具有良好的穩定性。 
    本研究考察了硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液在（6±2），（25±2） 和（40±2）℃條件下放置6個月的穩定性，結果表明該制劑在（6±2） 和（25±2）℃條件下均穩定。這提示，硫酸氫氯吡格雷亞微乳注射液的儲存溫度不宜太高，建議在（6±2）℃儲存。 
    來源：《中國新藥雜志》2012年第21卷第15期復方纈沙坦/苯磺酸氨氯地平片的制備和體外溶出測定 作者：靳靜，操鋒，平其能，張燦

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