卡維地洛瞬時效應(yīng)對兔肥厚左心室跨壁復(fù)極離散度及心律失常影響

　　心性猝死（sudden cardiac death，SCD）是心室肥厚及早期心力衰竭患者的主要死因［1,2］。卡維地洛（carvedilol，CVD）是第三代β受體阻滯劑的代表，COPERNICUS［3］、COMET［4］等臨床循證醫(yī)學(xué)試驗證實CVD能顯著降低上述患者預(yù)后，有關(guān)CVD上述效應(yīng)確切機制的探討已成為心臟學(xué)界熱點之一。國內(nèi)外研究［5，6］顯示：跨壁復(fù)極離散度（transmural dispersion of repolarization,TDR）顯著增大基礎(chǔ)上的跨室壁折返是引起多形性室速（polymorphic ventricular tachycardia，PMVT）、尖端扭轉(zhuǎn)性室速（torsade de pointes，Tdp），進而導(dǎo)致SCD的主要機制。本組先前研究［7］顯示：CVD長期干預(yù)能顯著降低TDR和室性心律失常率。但單細胞研究表明［8］：不同濃度的CVD能夠直接影響心肌細胞的跨膜離子流強度，進而改變心肌細胞復(fù)極過程以及動作電位特征，這種效應(yīng)具有瞬時性、濃度依賴性。該效應(yīng)是否與CVD預(yù)防SCD效果相關(guān)尚無報道。本研究以CVD長期灌胃的穩(wěn)定期血藥濃度為基準，探討CVD瞬時效應(yīng)對于兔肥厚左心室跨壁復(fù)極離散度及心律失常的影響。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 試驗動物 選擇10~12周齡健康大白兔，體重1 900~2 100 kg，由西安交通大學(xué)動物實驗中心提供。

　　1.1.2 儀器 多普勒超聲心動儀（HP Sonos 2500，USA）；DT-100型電子天平；MEZ-8301型、MEZ-7101型微電極放大器、SEN-7103型電刺激儀、SS-102J型刺激隔離器、VC-11雙線記憶示波器；手動微電極操縱器（帶千分微調(diào)尺）3臺；自制有機玻璃恒溫灌流肌浴槽；CS501型超級恒溫器；LDB-H型電子蠕動泵；玻璃微電極毛胚；PB-2型微電極拉制儀； PowerLab/8sp實驗數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)。

　　1.1.3 試劑 3%戊巴比妥鈉；臺氏液（Tyrode’s solution）構(gòu)成：NaCl 129.0 mmol/L,KCl 4.0 mmol/L,NaH2PO4 0.9 mmol/L,NaHCO3 20.0 mmol/L,CaCl2 1.8 mmol/L，MgSO4 0.5 mmol/L,葡萄糖5.5 mmol/L,胰島素1 u/L；心臟停搏液：KCl濃度為24 mmol/L的臺氏液。卡維地洛標準品由上海羅氏藥業(yè)集團提供。甲醇：色譜純，批號980711，天津市康科德科技有限公司生產(chǎn)；乙腈：購自上海勤工化學(xué)廠。

　　1.2 方法

　　1.2.1 左心室肥厚兔模型的制備及CVD灌胃 采用腎上腹主動脈部分結(jié)扎法制做兔左心室高后負荷模型［9］。腹主動脈結(jié)扎術(shù)后48 h，開始對兔進行CVD 1 mg/kg，每日2次灌胃，共持續(xù)10周。

　　1.2.2 CVD灌胃動物穩(wěn)定期血藥濃度測定 采用高效液相色譜分析法；以最后一次給藥后3～6 h內(nèi)的CVD血藥濃度為穩(wěn)定期血藥濃度。具體步驟：（1）耳緣靜脈采血4 ml，注入枸櫞酸鈉抗凝管中。4 ℃條件下，4000 r/min離心10 min，吸取上清液-20 ℃凍存。（2）標準空白血清制備：取正常成年兔全血100 ml，在4 ℃條件下，經(jīng)低溫高速離心后取血清部分凍存。（3）血樣處理：將1 ml血樣加入0.1 ml 0.1N的NaOH溶液中，再加入0.9 ml飽和NaCl溶液。用5 ml乙醚萃取。于-30 ℃冷凍后，倒出上層的有機相，加入250 μl磷酸鹽溶液（50 mmol,pH 2.0）進行反萃。取50 μl水層進樣。（4）標準曲線制作：在標準空白血清內(nèi)加入CVD標準品，配制成濃度為25、50、100、250、500、1000、2000 ng/ml的一系列血清樣品。按照樣品處理法處理后進行測定。根據(jù)測定結(jié)果擬合加權(quán)回歸方程，檢測波長240 nm。（5）精密度檢測和回收率試驗：精密度檢測采用日內(nèi)變異；取空白血清，加入定量的CVD標準品，配制50、250、1000 ng/ml濃度的卡維地洛溶液，在（285±1）nm處測定吸收度，計算回收率。（6）樣品濃度測定：將1 ml待測血清加入0.1 ml 0.1N的NaOH溶液中，再加入0.9 ml飽和NaCl溶液。用5 ml乙醚萃取。于-30 ℃冷凍后，倒出上層的有機相，加入250 μl磷酸鹽溶液（50 mmol，pH 2.0）進行反萃。精密測量水層樣50 μl注入色譜儀，記錄色譜圖，量取峰值面積。以穩(wěn)定期CVD濃度（HPLC法測定）為基準，在DMSO助溶下，配制含等濃度CVD的臺式液。記錄普通臺式液、CVD臺式液灌注（各持續(xù)1 h）對肥厚心肌標本動作電位和TDR的影響。

　　1.2.3 經(jīng)冠狀小動脈灌注的兔左心室楔形組織塊的制作和灌流 參照文獻［10］。肝素抗凝及戊巴比妥鈉充分麻醉基礎(chǔ)上，迅速開胸取出心臟放入4 ℃高鉀臺氏液中，使心臟停搏。以自制冠脈灌注管經(jīng)左冠狀動脈開口插入冠狀動脈左室支，予以臺氏液灌注，并結(jié)扎固定冠脈灌注管。分離出以冠脈血管為中心軸、長約10~20 mm、寬約5~10 mm厚約3~4 mm心室肌楔形組織塊，在恒溫肌浴槽內(nèi)固定。將冠脈灌注管連接蠕動泵行持續(xù)臺氏液灌流，保證灌注壓維持在20~30 mm Hg。在浴槽內(nèi)及灌流的臺氏液中持續(xù)充混合氣（95％O2與5％CO2），使pH值維持在7.35~7.45。溫度恒定于37 ℃。將自制雙極同心銀電極固定于組織塊的心內(nèi)膜面，給予基礎(chǔ)周長（basic cycle length，BCL）1 s的電刺激使組織塊平衡1 h。保持心電圖電極和心內(nèi)、外膜浮置玻璃微電極置于同一跨壁軸線上。

　　1.2.4 對比指標 對比臺式液、穩(wěn)定期CVD血藥濃度的臺式液分別灌注1 h時肥厚左心室標本APD、TDR以及QT間期變化；對比臺式液及CVD臺式液灌注過程中心律失常發(fā)生率的變化。動作電位時程（APD）以90％復(fù)極時的動作電位時程（APD90）計算；同一部位內(nèi)、外層心肌中APD差值（APDmax-APDmin）為跨壁復(fù)極離散度，本文以APD90離散度（APD90max-APD90min）作為TDR評價指標。

　　1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)值均采用（x±s）表示。采用SPSS 11.0軟件進行分析，兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗，率比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有顯著性。表1 普通臺式液及0.1 μmol/L CVD臺式液灌注時APD、TDR及QT間期比較注：同一肥厚心肌標本在0.1 μmol/L CVD臺式液與臺式液灌注1 h的APD90、TDR及QT間期相比較，各指標之間差異無顯著性（P＞0.05）

　　2 結(jié)果

　　2.1 卡維地洛灌胃組兔穩(wěn)定期血藥濃度測定 測定來自10只卡維地洛灌胃組兔的血樣標本，每只動物分離出3份，測定后取平均值。以上結(jié)果顯示灌胃組兔血液中卡維地洛濃度為（0.106±0.035）μmol/L，本研究取0.1 μmol/L為穩(wěn)定期血藥濃度。

　　2.2 0.1 μmol/L CVD臺式液灌注對于結(jié)扎組兔心肌標本APD、TDR的影響 在臺式液、0.1 μmol/L CVD臺式液灌注過程中，同一組肥厚左心室標本APD90和TDR的無顯著變化；室性心律失常發(fā)生率無顯著變化（P＞0.05）。

　　2.3 0.1 μmol/L CVD臺式液灌注對于結(jié)扎組標本室性心律失常的影響 臺式液灌注過程中，8/9例出現(xiàn)2或3相EAD，7/9例觸發(fā)R-on-T早搏，5/9例出現(xiàn)自發(fā)性PMVT或Tdp，三者發(fā)生率分別為88.9％、77.8％、55.6％；0.1 μmol/L CVD臺式液灌注過程中，8/9例發(fā)生EAD，7/9例出現(xiàn)R-on-T早搏，6/9例觸發(fā)PMVT或Tdp，三者發(fā)生率分別為88.9％、77.8％、66.7％。兩組標本的室性心律失常發(fā)生率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

　　3 討論

　　與其他β1受體阻滯劑不同，CVD能通過長期效應(yīng)和瞬時效應(yīng)兩種方式影響心室肌細胞的電生理特性，長期效應(yīng)指長期給藥對于心臟電重塑的改善，是神經(jīng)內(nèi)分泌拮抗、減輕心臟負荷、降低心肌耗氧、抗氧化應(yīng)激等的綜合體現(xiàn)。瞬時效應(yīng)指CVD能與多種心肌細胞離子通道的膜外位點瞬間形成低親和力結(jié)合，發(fā)揮通道阻滯作用。不同濃度的CVD能夠直接影響單個心肌細胞的多種跨膜離子流強度，包括復(fù)極相關(guān)電流Ikr、Ito、Ica-L和Iks，半數(shù)抑制濃度IC50分別為0.35、3.34、3.59和12.54 μmol/L［8］。該效應(yīng)具有以下特點：（1）靶通道具有多樣性和非特異性；（2）靶通道的類型、特定跨膜離子流抑制程度均和CVD濃度密切相關(guān)，而膜電壓無關(guān)；（3）離子通道阻滯效應(yīng)發(fā)生迅速，如CVD組織HERG基因編碼產(chǎn)物Ikr通道僅需2 min，起效遠快于其特異性通道阻斷劑Dofetilide［11］；（4）結(jié)合不緊密，能被灌流液部分洗脫。

　　在連續(xù)服用CVD的個體中，上述兩種效應(yīng)顯然同時存在。明確CVD的瞬時效應(yīng)對于肥厚左室心肌動作電位、跨壁復(fù)極離散度以及室性心律失常的影響，有利于加深對于CVD藥理機制的全面、深入理解，且對于CVD用藥方式具有重要指導(dǎo)意義。

　　CVD在口服給藥1~2 h達到血漿峰藥濃度，血漿清除半衰期2～8 h，體內(nèi)排除半衰期7～10 h。我們將采血時間控制在灌胃給藥后3～6 h，于血藥濃度峰值之后和第一個半衰期到來之前，這時的血藥濃度代表了整個干預(yù)過程中的穩(wěn)定濃度值，經(jīng)HPLC法測定近似于0.1 μmol/L。

　　與普通臺式液相比，0.1 μmol/L CVD灌注下肥厚心室肌電生理模型內(nèi)外膜動作電位、跨壁復(fù)極離散度及QT間期無顯著差異；在相同灌注時間內(nèi)，后除極、R-on-T室性早搏以及PMVT/Tdp的發(fā)生率差異不明顯。結(jié)合長期干預(yù)試驗［7］結(jié)果，筆者認為：CVD對離子流阻滯的瞬時效應(yīng)對肥厚心室心律失常的發(fā)生并無影響，究其原因可能與穩(wěn)定期血藥濃度（0.1 μmol/L）顯著低于其復(fù)極電流相關(guān)通道有效阻滯濃度（0.35~12.54 μmol/L）［8］有關(guān)；同時也表明CVD預(yù)防SCD、改善預(yù)后作用主要是通過其長期效應(yīng)來實現(xiàn)的。因此對于左心室肥厚以及心力衰竭患者，盡早、長期、全程應(yīng)用卡維地洛是改善預(yù)后的唯一途徑。（參考來源：卡維地洛瞬時效應(yīng)對兔肥厚左心室跨壁復(fù)極離散度及心律失常影響，崔長琮，中華現(xiàn)代內(nèi)科學(xué)雜志2007年第4卷第11期 ）

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