七十味珍珠丸抗大鼠腦血栓形成作用及機制研究

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　　摘要 目的:觀察七十味珍珠丸抗實驗性大鼠腦血栓形成的作用，并初步探討其作用機制。方法: 用結扎頸外動脈同時頸內動脈注射復合血栓誘導劑的方法建立實驗性腦血栓形成大鼠模型。以阿司匹林作為陽性對照組，觀察七十味珍珠丸對實驗性腦血栓大鼠腦梗塞區伊文思藍含量、腦水腫程度、血液流變學指標及血漿中血栓素A2( thromboxane A2，TXA2 ) 、前列環素( prostacyclin，PGI2 ) 水平的影響。結果:與模型組相比，七十味珍珠丸高劑量( 300 mg /kg) 、中劑量( 150 mg /kg) 、低劑量( 75 mg /kg) 都不同程度的減輕了實驗性模型大鼠腦血栓程度、腦水腫程度;降低了全血低切粘度、血漿粘度、紅細胞聚集指數; 同時抑制了模型大鼠血漿中TXA2 和PGI2 這對活性物質的失衡。結論:七十味珍珠丸可抑制血栓誘導劑誘導的腦血栓形成; 其機制可能與下調血液流變學指標和改善TXA2 /PGI2 系統失衡有關。

　　關鍵詞  七十味珍珠丸; 腦血栓形成; 腦水腫; 血液流變學; 血栓素A2( TXA2) ; 前列環素( PGI2)

　　七十味珍珠丸( Ｒannasangpei) 是最有代表性的、應用最廣、療效顯著的藏成藥之一，主要由佐太、天然珍珠、天然牛黃、羚羊角、麝香、藏紅花、檀香、安息香、降香、九眼石、瑪瑙、珊瑚等70 余味名貴藏藥組成［1］，具有通經活絡，調和氣血，安神、鎮靜，醒腦開竅之功效。而目前研究七十味珍珠丸抗腦血栓的文獻甚少。因此，本實驗通過檢測實驗性腦血栓大鼠腦梗塞區伊文思藍含量和腦水腫程度來觀察七十味珍珠丸抗腦血栓作用，同時，通過測定實驗性腦血栓大鼠血液流變學各指標和血栓素A2( TXA2) 、前列環素( PGI2) 水平來探討其抗腦血栓的機制。

　　1 材料與方法

　　1． 1 實驗藥品七十味珍珠丸由北京藏醫院提供，批號:

　　20120809。阿司匹林腸溶片由亞寶藥業太原制藥有限公司提供，批號: 20120802。

　　1． 2 動物SPF 級SD 大鼠96 只，體重250 ～ 300g，雌雄各半，由南方醫科大學實驗動物中心提供，合格證號: SCXK 粵2011-0015( NO: 44002100000736) 。

　　1． 3 試劑鹽酸腎上腺素注射液( Adrenaline HydrochlorideInjection ) 為上海禾豐制藥有限公司生產; 5 ＇-二磷酸腺苷( 5 ＇-ADP-Na2) 、凝血酶( Thrombin) 、伊文思蘭( Evens blue) 、硫酸鈉( Na2SO4) 分析純、丙酮分析純、血栓素B2( TXB2) ELISA 試劑盒、6-酮-前列腺素F1α( 6-keto-PGF1α) ELISA 試劑盒均購自廣州拓科達生物科技有限公司。

　　1． 4 儀器2K-15 低溫離心機由南方醫科大學生命科學樓解剖教研室提供。血液流變分析儀由南方醫院檢驗科提供。

　　1． 5 方法250 ～ 300g 大鼠96 只，分為兩批，每批隨機分為6組，即空白組、模型組、七十味高劑量組( 300 mg /kg) 、七十味中劑量組( 150 mg /kg) 、七十味低劑量組( 75 mg /kg) 、阿司匹林組( 8． 24 mg /kg) ，每組各8 只大鼠。每天灌胃給藥1 次( 按體表面積法) ，連續14 天，于造模前1h 給藥1 次，給藥劑量及途徑同前，空白組和模型組用蒸餾水灌胃。第一批: 進行腦血栓程度( 腦梗塞區每克腦組織中伊文思藍含量) 和腦水腫程度的檢測;第二批: 進行血液流變學、血栓烷B2( thromboxane B2，TXB2) 及6-酮-前列腺素F1α( 6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α) 水平的檢測。

　　末次給藥1h 后，進行腦血栓形成實驗，實驗時腹腔注射10%水合氯醛( 0． 35g /kg) 麻醉，左頸總動脈、左側頸外動脈，穿線備用，先結扎左側頸外動脈，然后結扎左頸總動脈近心端，用大鼠動脈夾在距遠心端離結扎處約1cm 的地方夾閉以便再通，在左頸總動脈結扎處與夾閉處之間剪一小口，以直角針頭從小口向頭部方向進針注射復合血栓誘導劑，注射時打開動脈夾使血管再通，注射完畢再夾閉［2］。除空白組外，其余各組由左頸總動脈剪口處注入復合血栓誘導劑( 二磷酸腺苷1． 25mmol /L: 凝血酶1． 25 萬u /L: 腎上腺素1g /L = 100: 200: 5) 100g 體重0．1ml，空白組注入等量生理鹽水。

　　1． 5． 1 腦血栓程度、腦水腫程度檢測第一批大鼠注入復合血栓誘導劑10min 后，注入0． 2%伊文思藍100g 體重0． 5ml，再過5min 后迅速斷頭，冰中取腦，用生理鹽水洗去殘血，濾紙吸干，分析天平稱重后，剪成碎片，置于電動勻漿器中，加入0． 5%Na2 SO4: 丙酮= 3: 7，制成勻漿液( 5ml /每克腦) ，將勻漿液倒入加蓋試管中，4℃ 密封放置6h，4000rpm 離心10min，取上清液3ml 移入試管，然后再以5000rpm 離心10min，取上清液，以生理鹽水調零，用可見分光光度計在620nm 處以1cm 光徑比色，測定吸光度( A) 值，以栓塞半球( 左側為梗塞區，右側為對照區)的光密度A 與其腦重量之比( A/左腦濕重) 表示伊文思藍的含量，以此表示腦血栓的嚴重程度。以梗塞區半球( 左側) 重量與對照右半球重量的比值( 左/右腦濕重) 表示梗塞側腦水腫的程度［3］。

　　1． 5． 2 血液流變學指標檢測第二批大鼠注入復合血栓誘導劑后用縫線結扎針眼，縫合皮膚，單籠飼養。造模24h 后，經腹腔注射麻醉大鼠，使用一次性負壓檸檬酸鈉( 1: 9) 采血管從腹主動脈采血6ml，其中5ml 血樣送南方醫院檢驗科測血液流變學各項指標: 全血粘度低切( BGH 10s-1) 、全血粘度中切( BGH60 s-1) 、全血粘度高切( BGH 150 s-1) 、血漿粘度( PGLUT) 、紅細胞聚集指數( ＲBCJJZS) 。

 　　1． 5． 3 血漿中TXB2、6-keto-PGF1α 及TXB2 /6-keto-PGF1α 水平測定上述剩余1ml 血樣3000 rpm 4℃ 離心20min，取血漿分裝，-20℃保存，按ELISA 試劑盒說明書測定TXB2及6-keto-PGF1α 水平。

　　2 結果

　　2． 1 七十味珍珠丸對實驗性腦血栓大鼠腦梗塞區伊文思藍含量的影響腦血栓模型制造后，肉眼可明顯看出左側腦半球藍染，右半球看不出藍染，說明左側半球血栓模型制造成功［3］。

　　與空白組比較，模型組A/左腦濕重明顯升高; 與模型組比較，七十味高劑量組( 300 mg /kg) 、中劑量組( 150 mg /kg) 、低劑量組( 75 mg /kg) 和阿司匹林組( 8． 24 mg /kg) 都不同程度的降低了A/左腦的比值; 而七十味高、中、低劑量組與阿司匹林組比較均無統計學差異，見表1。

　　2． 2 七十味珍珠丸對實驗性腦血栓大鼠左右半球濕重的影響與空白組比較，模型組左/右腦濕重明顯升高; 與模型組比較，七十味高劑量組( 300 mg /kg) 、中劑量組( 150 mg /kg) 、低劑量組( 75 mg /kg) 、阿司匹林組( 8． 24 mg /kg) 都不同程度的降低了左、右腦濕重比值; 而七十味各組與阿司匹林組比較均無統計學差異。

　　2． 3 七十味珍珠丸對實驗性腦血栓大鼠血液流變學各指標的影響與空白組比較，模型組大鼠全血粘度低切( BGH 10 s-1 ) 、中切( BGH 60 s-1 ) 、高切( BGH 150 s-1 ) 、血漿粘度( PGLUT) 、紅細胞聚集指數( ＲBCJJZS) 都明顯升高。與模型組比較，七十味高劑量組( 300 mg /kg) 、中劑量組( 150 mg /kg) 、低劑量組( 75mg /kg) 和阿司匹林組( 8． 24 mg /kg) 都不同程度的降低了全血粘度( 低切) 、血漿粘度、紅細胞聚集指數; 中切和高切無差異。

　　2． 4 七十味珍珠丸對實驗性腦血栓大鼠血漿中TXB2、6-keto-PGF1α 水平及TXB2 /6-keto-PGF1α 比值的影響與空白組比較，模型組大鼠血漿中TXB2、6-keto-PGF1α 的含量明顯升高，TXB2 /6-keto-PGF1α 比例也明顯升高; 與模型組比較，七十味珍珠丸各劑量和阿司匹林都不同程度降低了大鼠血漿中TXB2、6-keto-PGF1α 的含量，并明顯降低了異常升高的TXB2 /6-keto-PGF1α 比例; 以上三項指標，七十味高劑量組與阿司匹林組相比均無統計學差異。而七十味中、低劑量組和阿司匹林組大鼠血漿中6-keto-PGF1α 的含量無差異。

　　3 討論在臨床病理過程中，腦血栓是受多種因素作用經多種途徑而誘發形成的，血管內皮損傷與血管收縮、血小板聚集與釋放、纖維蛋白凝固等參與這一過程，因此，單純以一種致栓劑不能真正全面的模擬腦血栓形成的病理。已知二磷酸腺苷( adenosinediphosphate，ADP) 可通過結合血小板膜受體，抑制腺苷酸環化酶，引起細胞內Ca2 + 濃度升高，激活血小板，提高血小板磷脂酶A2 活性，促進血小板內花生四烯酸代謝，增加TXA2 的生成與活性，誘導血小板聚集［4］。凝血酶可使血液中的纖維蛋白原轉變成纖維蛋白促使血液凝固［5］。而腎上腺素能促進血管收縮，因此，本實驗選用二磷酸腺苷、凝血酶和腎上腺素配成復合血栓誘導劑，通過頸內動脈注射法建立腦血栓模型，這種造模方法能更好地模擬血栓形成的病理過程和實際情況。

　　伊文思藍( EB) 是一種偶氮基熒光染料，它具有能在體內外與血清白蛋白結合的特性［6］。正常情況下EB 進入體內后與血清白蛋白結合不能通過血腦屏障( BBB) ，只有在病理情況下影響了腦血管的通透性時，伊文思藍就會通過血管壁進入腦組織，因此，通過測定每克血栓側腦組織中伊文思藍的含量( A 值) 可以評價腦血管的通透性，從而衡量腦血栓的嚴重程度。此外，由于腦血栓形成后腦血管通透性的升高，導致組織間隙水腫，形成腦水腫，本實驗利用左/右腦濕重來評定血栓側腦水腫的嚴重程度。造模后，模型組A/左腦的比值和左腦/右腦的比值都明顯升高，表明復合型血栓誘導劑造成了模型組大鼠腦血栓的形成，腦血管通透性增加，進而導致嚴重腦水腫。七十味高劑量組( 300 mg /kg) 、中劑量組( 150 mg /kg) 、低劑量組( 75 mg /kg) 的A/左腦、左腦/右腦比值與模型組相比都明顯降低，表明七十味珍珠丸可以抑制血栓誘導劑造成的腦血栓形成，抑制腦血管通透性增加，減輕腦水腫。

　　血流速度在全身或局部減慢、在局部形成渦流均可促進血栓形成及凝血［7］，表明血液流變學的病理改變( 血液粘度增高，血液濃縮，血流變慢等) 也是造成腦血栓形成至關重要的誘因之一。造模后，模型組全血粘度( 低切、中切、高切) 、血漿粘度、紅細胞聚集指數都明顯升高，表明復合型血栓誘導劑造成了大鼠血液流變學各指標的上調，產生了病理改變。而七十味珍珠丸各組與模型組相比都不同程度的降低了全血粘度( 低切) 、血漿粘度、紅細胞聚集指數，表明七十味珍珠丸可以抑制復合型血栓誘導對大鼠血液流變學指標的上調，具有抗血栓形成的功效。

　　同時，血小板的黏附、聚集和釋放功能與腦血栓形成有著密切關系。血栓素A2( TXA2) 和前列環素( PGI2) 是機體內調節血小板聚集的一對生物活性物質，二者的平衡是影響血小板功能的主要因素。TXA2是作用強烈的血管收縮因子，能使腦動脈痙攣，血管通透性增加，并能使血小板迅速聚集，促進腦血栓和腦水腫形成，因此，TXA2是測定血小板活化程度的敏感且特異性較高的指標之一［8］。而PGI2 是一種重要的抑制血管收縮物質，由內皮細胞釋放，具有擴張血管、抑制血小板聚集、穩定細胞膜等作用［9］。血漿或組織中的TXA2-PGI2比例失衡是造成血小板聚集、血管痙攣收縮或血栓形成的原因之一。TXA2和PGI2的半衰期很短，但它們的代謝產物TXB2、6-keto-PGF1α 比較穩定，測定二者的含量可直接反映機體TXA2和PGI2的水平［10］。

　　本實驗采用復合血栓誘導劑復制實驗性腦血栓大鼠模型，造模后血漿中TXB2、6-keto-PGF1α 含量及TXB2 /6-keto-PGF1α 比例異常升高( P ＜ 0． 01) ，表明在復合血栓誘導劑的作用下，血小板和血管內皮細胞均被激活，合成TXA2和PGI2增多，使TXA2 /PGI2失衡。而與模型組相比，七十味高劑量組( 300 mg /kg) 、中劑量組( 150 mg /kg) 、低劑量組( 75 mg /kg) 都不同程度降低了血漿中TXB2、6-keto-PGF1α 的含量，并降低了異常升高的TXB2 /6-keto-PGF1α 比例，表明七十味珍珠丸能抑制復合血栓誘導劑導致的TXA2和PGI2升高，可以調節TXA2和PGI2之間的動態平衡，從而抑制了血小板的聚集和血栓形成。

　　本次實驗結果提示: 七十味珍珠丸對血栓誘導劑誘導的腦血栓形成具有抑制作用，可防止腦血栓形成后腦血管通透性增加，減輕腦水腫。七十味珍珠丸抗腦血栓作用機制可能與下調血液流變學各指標和調節TXA2、PGI2之間的動態平衡有關。 
 

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