10種中草藥提取物對痤瘡致病菌的體外抑菌活性研究

【摘要】目的：研究10種中草藥對痤瘡致病菌的體外抑菌活性。方法：制備10種中草藥提取物，采用牛津杯抑茵圈法定性檢測中草藥對金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌的抑菌活性，然后通過2倍稀釋法定量檢測其最小抑茵濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。結果：10種中草藥提取物中大黃、黃柏、丁香、姜黃4種中草藥對兩種致病茵均有抑菌作用；其中大黃的抑茵效果最好，對金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌的最小抑菌濃度分別為3.125、6.25 mg/mL，最小殺茵濃度分別為6.25、12.50 mg/mL。

【關鍵詞】中草藥；金黃色葡萄球菌；痤瘡丙酸桿菌；體外抑茵實驗；最小抑菌濃度

 

痤瘡是一種皮脂腺的慢性皮膚疾病，痤瘡的主要致病菌是痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌，目前抗痤瘡藥物活性評價主要考察對這兩種菌的抑菌作用，減少皮膚毛囊中痤瘡主要致病菌的數量是祛痘類化妝品的主要途徑之一。

 

中草藥是我國傳統醫學的中藥組成部分，主要由植物的根、莖、葉、果構成。目前我國各地常使用的藥用植物達5000種左右，把各種藥材相配伍而形成的方劑，更是數不勝數。中草藥價格低廉，資源豐富，含有多種活性成分，其富含的活性物質毒副作用小，在人體皮膚上產生不良反應機會少。近年來，安全、綠色、天然的中草藥植物作為祛痘化妝品的主要功效添加劑已成為一種流行趨勢。

 

實驗前，對國內近20年涉及“中藥”、“外用”、“痤瘡”的文獻報道進行調研，選擇10種常見的中草藥作為本實驗研究對象，即大黃、艾葉、丁香、黃柏、苦參、蒲公英、蛇床子、仙鶴草、茵陳、姜黃，將10種中草藥分別對金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌進行體外抑菌實驗和最小抑菌濃度測定，旨在篩選抑菌活性強的中草藥，為今后祛痘化妝品開發中草藥添加劑提供依據。

 

1 材料

1.1 藥材 大黃、艾葉、丁香、黃柏、苦參、蒲公英、蛇床子、仙鶴草、茵陳、姜黃，購于北京同仁堂藥房。

1.2 菌株 痤瘡丙酸桿菌標準菌株ATCC11827、金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC100817，廣東微生物菌種保藏中心提供。

1.3 儀器 UV2300紫外可見分光光度計，上海天美有限責任公司；BS21S精密電子天平，德國賽多利斯天平有限公司；LS-B50L立式壓力高壓滅菌鍋，上海醫用核子儀器廠；DH5000AB電熱恒溫培養箱，天津市泰斯特儀器有限公司；麥氏比濁管，法國梅利埃公司；Gamma厭氧手套箱，北京迪索儀器有限公司。

1.4 試劑 痤瘡丙酸桿菌培養基：腦心浸液培養基；金黃色葡萄球菌：牛肉膏培養基，均購于北京陸橋技術有限公司。

 

2 方法

2.1 培養基的制備 培養基按常規方法配制，調pH值為7.1~7.2。將培養基于錐形瓶中密封好后，放入滅菌鍋中于121℃下滅菌30 min，待冷卻后，置于4℃冰箱中保存備用。

 

2.2 中草藥供試液制備將中草藥放入烘箱中，于50%處理12 h，然后分別準確稱取10 g各中草藥飲片，用粉碎機粉碎，取干粉1：20的比例溶于200 mL水中，浸泡30 min，然后文火煎煮60 min，靜置至室溫。用200目紗布過濾取清液，70℃下真空旋蒸濃縮至各濾液濃度為1 g/mL，即得中藥提取液。

 

2.3 菌懸液的制備 將標準菌株分別接種培養增菌，在常規培養條件下培養24 h（痤瘡丙酸桿菌用厭氧手套箱培養48 h），吸取菌液用培養基稀釋調整為0.5個麥氏比濁單位（約為1.5×10⁸ CFU/mL），將菌懸液用培養基繼續稀釋，用麥氏比濁儀將調整為1×10⁶~10⁵ CFU/mL，備用。

 

2.4 抑菌圈測定 根據參考文獻，對實驗方法進行改良。在無菌操作條件下，分別取上述菌懸液，用涂布棒均勻涂抹在培養基上。再用無菌鑷將牛津杯輕放在凝固的培養基表面，輕壓牛津杯使接觸良好。用一次性注射針吸取供試液于牛津杯中，37qC培養箱培養24 h后取出（痤瘡丙酸桿菌用厭氧手套箱培養48 h），用卡尺準確測量各培養皿中供試液有效抑菌圈的直徑。各樣品重復3次。另外配制對照組：空白對照組（培養基）、陰性對照組（培養基、菌懸液、無菌水）、陽性對照組（培養基、菌懸液、紅霉素），來觀察細菌的生長情況、培養基和中草藥對細菌生長的影響。

 

2.5 最小抑菌濃度（MIC）測定 采用試管2倍稀釋法，測定各中藥供試液最小抑菌濃度（MIC）。在2.4中對兩種致病菌均有抑菌效果的中藥供試液用液體培養基依次稀釋10、20、40、80、160、320、640、1280和2560倍。即最終藥液濃度分別為l00 mg/mL、50 mg/mL、25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.5625 mg/mL、0.7825 mg/mL、0.3913 mg/mL。在1 mL的稀釋液中加入0.1 mL的菌懸液。并設無藥菌液對照管、純中藥對照管和陽性對照管。37℃培養24 h（痤瘡丙酸桿菌用厭氧手套箱培養48 h），觀察結果。從無菌生長的各管中找出最低稀釋液濃度的實驗管，確定MIC。

 

將在MIC測定中，未見細菌生長的各管培養物中吸取0.1 mL涂布于固體培養基上，37℃條件下培養24 h（痤瘡丙酸桿菌用厭氧手套箱培養48 h），觀察結果。以仍無細菌生長的管內中藥供試液濃度記為MBC。

 

3 結果

體外抑菌實驗結果表明，空白對照組培養基澄清，說明培養基實驗過程中沒有被污染，對實驗結果沒有干擾。陰性對照組無抑菌圈產生，說明本實驗結果有效。所選10種中草藥對金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌呈現部分抑制作用，如表l所示。其中大黃和黃柏對金黃色葡萄球菌的抑菌直徑為26.63、21.72 mm，對痤瘡丙酸桿菌的抑菌直徑為24.20、19.05 mm，對兩種菌均有較好的抑制作用；其次是丁香和姜黃對金黃色葡萄球菌的抑菌直徑為17.01、15.75 mm，對痤瘡丙酸桿菌的抑菌直徑為18.31、13.62 mm；艾葉對金黃色葡萄球菌的抑制作用較強，抑菌直徑為23.19 mm，對痤瘡丙酸桿菌無抑菌活性；苦參、蒲公英、蛇床子、仙鶴草、茵陳對金黃色葡萄球菌的抑菌活性一般，抑菌直徑分別為l6.52、l5.21、16.81、13.47、16.65 mm，對痤瘡丙酸桿菌均無抑菌活性；與陽性對照相比，抑菌活性均相對較弱。比較而言所選10種中草藥對金黃的葡萄球菌的抑菌活性明顯強于對痤瘡丙酸桿菌的抑菌活性。其原因可能與菌種、中草藥種類及其活性成分、濃度、中藥抑菌作用機制和用藥環境等有關。

最小抑菌濃度測定結果，通過2.4抑菌圈實驗篩選出大黃、丁香、黃柏、姜黃4種對金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌均有抑制作用的中草藥作為研究對象。由表2、表3可知，4種中草藥受試液對兩種痤瘡致病菌的抑制作用程度不同，其中對金黃色葡萄球菌的抑菌程度依次為大黃3.125 mg/mL、黃柏12.5 mg/mL、姜黃25.0 mg/mL、丁香50.0 mg/mL；對痤瘡丙酸桿菌抑菌程度依次為大黃6.25 mg/mL、黃柏25.0mg/mL、丁香25.0 mg/mL、姜黃50.0 mg/mL。在MIC的測定基礎上，對4種中草藥的最小殺菌濃度（MBC）進行測定，其中對金黃色葡萄球菌的殺菌程度依次為大黃6.25 mg/mL、黃柏25.0 mg/mL、姜黃25.0 mg/mL、丁香100.0 mg/mL；對痤瘡丙酸桿菌殺菌程度依次為大黃6.25 mg/mL、黃柏25.0 mg/mL、丁香25.0 mg/mL、姜黃50.0 mg/mL。所以，所測試的中草藥中，大黃對金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌均具有最好的抑菌效果和殺菌效果。

 

4 討論

痤瘡丙酸桿菌是丙酸桿菌屬的小桿菌，是定居于人類皮膚毛囊皮脂腺濾泡中的最主要的微生物。痤瘡丙酸桿菌能產生很多胞外酶和特異的炎前因子，將皮脂內的甘油三脂分解為游離脂肪酸、透明質酸酶等，促進皮脂分泌，促使金黃色葡萄球菌等繁殖，從而引起炎癥性丘疹、膿皰。痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌與痤瘡發生的多個環節中都有緊密的關系，能誘發或加重痤瘡癥狀，所以，用祛痘類化妝品減少皮膚毛囊中的痤瘡主要致病菌的數量是目前預防痤瘡感染和痤瘡患者日常護膚的主要途徑之一。

 

本試驗選用痤瘡主要致病菌痤瘡丙酸桿菌、金黃色葡萄球菌作為試驗菌，考察了10種中草藥對以上兩種致病菌的抑菌活性。結果表明，10種中草藥提取物通過抑菌圈法初篩后發現，只有大黃、丁香、黃柏、姜黃4種中草藥對兩種菌均有抑菌活性，其中大黃對金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌的抑菌直徑分別為26.63、24.20 mm，抑菌活性相對較強；在此基礎上對篩選出的4種中草藥對兩種菌的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）進行檢測，大黃的MIC分別為3.125、6.25 mg/mL，MBC分別為6.25、12.5 mgmL，在4種中草藥中抑菌和殺菌效果相對最好。

 

本實驗采用中草藥煎劑測定其對痤瘡致病菌的抑菌效果，實驗所需設備簡單，操作方法簡便，可以在較短的時問內完成大量中草藥的篩選。在試驗過程中對各種操作細節嚴格加以控制，定量準確，故其結果相對較為可靠，可作為深入研究的依據。但是由于本實驗主要研究中草藥的體外抑菌效果，尚缺乏臨床驗證，藥物在人體皮膚上的作用機制比體外相對復雜，所以作為祛痘化妝品作用于人體皮膚時能否達到與體外相同的效果，有待進一步驗證。

 

現代藥理學的研究證明，許多中草藥都有較好的抑菌、殺菌作用。本實驗研究以我國豐富的中草藥為原料，選用的是安全性高并具有清熱解毒之功效的中草藥，本實驗結果從一個側面說明中草藥對兩種受試菌具有一定的抑制作用。其臨床應用前景樂觀，值得研究開發和利用。 

（陳志蓉，董銀卯，孟宏，邳楠，10種中草藥提取物對痤瘡致病菌的體外抑菌活性研究[J]中醫藥學報，2011年第39卷第6期：24-26）

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