淋病奈瑟菌耐藥性與耐藥基因的研究進展

【摘要】隨著抗生素的廣泛使用，淋病奈瑟菌對常用的抗生素產生了不同程度的耐藥。現綜述近年淋病奈瑟菌的耐藥性及耐藥基因的研究進展，包括：改變PBPs的胞內作用靶位，導致對青霉素類抗生素的耐藥，gyrA基因、parC基因和norm基因的突變，導致對氟喹諾酮類抗生素的耐藥，藥物外排機制引起多重抗生素的通透性降低，teM-1基因和tetM基因編碼的胞質蛋白抑制了四環素類藥物對細菌的毒性作用，阿奇霉素和大觀霉素耐藥與作用靶位的改變等。

【關鍵詞】淋病奈瑟菌；耐藥性；耐藥基因

 

淋病是目前世界上流行的性傳播疾病之一，淋病奈瑟菌為其病原體。據WHO估計，全球每年新發病例超過6000萬。由于抗生素的不合理使用，淋病奈瑟菌對其產生了不同程度的耐藥性。Ray等報道，在斯里蘭卡，淋病奈瑟菌對青霉素的耐藥率高達96.8%，8.2%的淋病奈瑟菌耐四環素；在孟加拉，耐青霉素的淋病奈瑟菌達到33%，耐四環素的菌株達到50%，76%的菌株耐環丙沙星。我國各地的淋病奈瑟菌耐藥也均有報道，山西大同地區2009年有77%的淋病奈瑟菌耐青霉素，93%耐四環素，而淋病奈瑟菌對環丙沙星100%耐藥。廣州地區2005~2009年間淋病奈瑟菌對青霉素、四環素、環丙沙星、大觀霉素、頭孢曲松的耐藥率分別為59.38%、59.38%、66.41%、0.79%、1.56%。新疆地區2007年淋病奈瑟菌對青霉素、頭孢曲松、阿奇霉素的耐藥率分別為57.1%、28.6%、33.2%。可見，淋病奈瑟菌的耐藥現象已十分普遍，淋病奈瑟菌的耐藥也成為淋病防治工作中的一大難題。現將近年來淋病奈瑟菌的耐藥性及其耐藥基因的研究進展綜述如下。

 

1 penA基因和ponA基因突變導致青霉素類耐藥

淋病奈瑟菌上的青霉素結合蛋白(penicillin binding protein，PBPs)是青霉素的主要結合靶點。青霉素含有β-內酰胺，β-內酰胺是通過與PBPs共價結合而阻止細胞壁的合成來殺滅淋病奈瑟菌。Powell等研究表明，淋病奈瑟菌可產生4種分子質量的PBPs：兩種高分子質量的A類PBP1和B類PBP2；兩種低分子質量的C類PBPs：PBP3和PBP4。PBP1和PBP2是β-內酰胺類抗生素最主要的結合靶位點，尤其是PBP2，染色體介導的淋球菌對青霉素的耐藥部分是由于PBP2突變所引起。編碼PBP2的基因penA基因出現點突變，在氨基酸排列第345號和第346號位置中插入一個天冬氨酸(Asp-345a)，同時該蛋白的c末端發生4~6個氨基酸的替換，導致PBP2結構的改變。青霉素作用的另一靶位是PBP1，PBP1是由ponA基因編碼的。如果PBP1氨基端第40位氨基酸突變，則淋球菌對青霉素的最低抑菌濃度≥1g/L，與野生菌株相比，耐藥菌株對β-內酰胺類抗生素的敏感性降低。penA基因和ponA基因的突變都會導致其編碼的PBPs相應氨基酸序列的改變，使B.內酰胺類抗生素對淋球菌的酰化速度降低，增強淋球菌的耐藥性。

 

2 gyrA基因、parC基因和norm基因的突變引起氟喹諾酮類耐藥

淋病奈瑟球菌DNA的復制和重組需要螺旋酶和拓撲異構酶，同時，這兩種酶也是淋病奈瑟菌生長所必需的酶。氟喹諾酮類藥物可以通過抑制螺旋酶和拓撲異構酶的作用而起到抑菌作用。編碼這兩種酶的基因發生點突變，形成新的氨基酸，將影響喹諾酮類藥物與淋病奈瑟菌上靶位的正常結合，降低了細菌的敏感性，淋病奈瑟菌的耐藥性也隨之形成。早年國外的研究發現，淋病奈瑟菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥與編碼DNA旋轉酶和拓撲異構酶Ⅳ的gyrA基因和parC基因上的一段核苷酸序列的突變有關(DNA旋轉酶A亞單位由gyrA基因編碼，拓撲異構酶Ⅳ的C亞單位由parC基因編碼)，該基因突變位點集中發生在該核苷酸序列N端199~318區間內，該區域稱為氟喹諾酮耐藥決定區。

 

廖經忠等對淋球菌喹諾酮類藥物作用靶位編碼基因gyrA和parC的喹諾酮耐藥決定區進行了聚合酶鏈反應擴增和直接測序分析，分別用氧氟沙星、氟羅沙星、洛美沙星、依諾沙星這4種喹諾酮類抗生素，結果發現淋病奈瑟菌對環丙沙星敏感的淋病奈瑟菌株gyrA基因和parC基因均未發生突變，而中介菌株或耐藥菌株均出現gyrA基因突變或同時伴有parC基因突變，并且所有parC基因突變均發生在gyrA基因突變的基礎上。gyrA基因發生了Ser91→Tyr、Ser91→Phe、Asp95→Gly、Asp95→Ala、Asp95→Asn等基因的突變，parC基因發生了Gly85→Cys、Asp86→Asn、Ser87→ Arg、Ser87→Ile、Ser87→Asn、Ser88→Pro、Glu91→Lys、Glu91→Gly等基因的突變，突變頻率最高的為gyrA：Ser91→Phe。與喹諾酮類耐藥性相關的淋病奈瑟菌基因還有gyrB和parE等，喹諾酮的高度耐藥是由gyrA基因的突變引起，而低度耐藥主要是由gyrB基因的突變引起。

 

Norm系統也參與調節喹諾酮類抗生素的耐藥。Norm基因介導的抗生素耐藥發生在其啟動子235區域，該區域發生的點突變可增強淋病奈瑟菌對喹諾酮類抗生素的耐藥性。

 

3 藥物外排機制導致多重抗生素通透性降低

隨著抗生素的廣泛使用，越來越多的淋病奈瑟菌已不對單一抗生素敏感，出現對多種抗生素同時耐藥的現象，即多重耐藥性，且有從低水平耐藥向高水平耐藥發展的趨勢。國內外的研究均表明，淋病奈瑟菌的多重耐藥性與其多重傳遞耐藥(multiple transferable resistance，MTR)系統的基因突變引起的藥物外排機制有關。近年的研究表明，引起淋病奈瑟菌多重耐藥的基因主要有mtrR基因和mtrF基因。

 

mtrR基因系統主要包括mtrR基因和mtrCDE基因。mtrCDE基因位于mtrR基因的下游，主要在轉錄水平發揮其調節機制。mtrCDE啟動子區有一段長度為26bp的區域，該區域中有mtrR的啟動子35區，mtrR與mtrCDE就在該區域結合。mtrCDE編碼mtrC基因、mtrD基因和mtrE基因，此三者形成一個完整的三聯體結構。mtrR編碼一種含有210個氨基酸的阻遏蛋白，該阻遏蛋白能夠與mtrC基因上轉錄啟動子結合。mtrR基因的突變可以使其下游的mtrCDE基因的轉錄開放，mtrCDE基因編碼的外膜蛋白復合物增多，外排物質相應增多。淋病奈瑟菌的外排系統是由細胞膜上的脂蛋白在ATP酶的催化下完成的，該主動外排系統能夠泵出疏水性的去污劑類、膽鹽和脂溶性抗生素等疏水性因子，引起淋病奈瑟菌的耐藥性。另有研究表明，淋病奈瑟菌mtrR基因的突變主要表現為3種形式：第45位的Gly(GGC→GAC)Asp、第14位的His(CAC→CGC)Arg和第51位的Phe(TTC→GTC)Val。第45位和第51位的氨基酸位于DNA結合蛋白α-螺旋-轉折-α-螺旋的超二級基序的第二個α螺旋，mtrR基因的突變導致此螺旋的破壞，從而使mtrR與mtrCDE的結合力下降，mtrR基因的阻遏作用減弱，增加了淋病奈瑟菌對抗生素的耐藥性。

 

在mtrR基因的啟動子區，有一個13bp的回文序列，該序列基因的突變也會導致淋病奈瑟菌耐藥性的產生。該序列不受mtrR基因的調控，主要突變為形式為mtrR啟動子區13bp回文序列5AAAAAGTCTTTTT3′的5′端發生了一個T/A堿基的缺失。王東梅等對32株淋病奈瑟菌進行研究，結果發現其中的13株有此突變，可見13bp回文序列與淋病奈瑟菌的耐藥性也有密切關系。

 

在淋病奈瑟菌的多重耐藥性中，mtrF基因也發揮著重要作用。mtrF基因位于mtrR基因下游的22bp處，與mtrCDE外排泵的關系密切。王冬梅等根據淋病奈瑟茵MIC的不同，用瓊脂擴散敏感試驗法把32株臨床菌種分為敏感組、低中等水平多重耐藥組和高度多重耐藥組，并用反轉錄。聚合酶鏈反應檢測3組中mtrF基因的表達情況，結果顯示：高度多重耐藥組中mtrF基因的表達量明顯多于敏感組和低中等水平多重耐藥組，推測mtrF基因可能參與淋病奈瑟菌高水平的多重耐藥，而mtrR基因只參與淋病奈瑟菌基礎水平的多重耐藥。mtrF基因介導的淋病奈瑟菌高度多重耐藥機制尚待進一步研究。

 

淋病奈瑟菌對抗生素的外排機制也與淋病奈瑟菌細胞膜上的Far系統有關。Far系統發揮作用需依靠淋病奈瑟菌的外膜通道蛋白mtrE，該系統對長鏈脂肪酸有耐受性，且該系統受到外膜通道蛋白mtrE的調控。

 

4 質粒介導耐藥與TEM-1基因和tetM基因的關系

淋病奈瑟菌的耐藥質粒迄今為止發現有2.6×10⁶的隱蔽性質粒、耐青霉素質粒(2.9×10⁶的里約型、3.5×10⁶的多倫多型、3.2×10⁶ 的非洲型、4.0×10⁶的尼姆斯型、6.0×10⁶的新西蘭型及4.4×10⁶的亞洲型)、25.2×10⁶的耐四環素質粒和24.5×10⁶的接合型質粒。王德霞等引用堿裂解法抽提質粒，對江蘇省揚州地區淋病奈瑟菌耐藥質粒譜進行研究，并對所抽提質粒分子質量的大小進行測定，結果：含4.4×10⁶的“亞洲型”耐青霉素質粒占73.7%。可見，我國介導質粒耐藥的主要為亞洲型。

 

淋病奈瑟菌的耐藥質粒可以通過轉化和接合兩種方式在菌株間傳遞。淋病奈瑟菌的耐藥質粒又稱R質粒，能夠編碼合成破壞抗生素的酶。另有一種為F質粒，它所編碼的蛋白質能夠使兩個細菌間接合，進而傳遞細菌間的遺傳物質。淋病奈瑟菌間的耐藥R質粒正是通過F質粒進行傳遞。

 

淋病奈瑟菌耐青霉素質粒中含teM-1基因，該基因主要以轉座子TnA基因的形式存在于淋病奈瑟菌的耐藥質粒中，并通過接合和轉化的方式在細菌間傳遞。teM-1基因可編碼β-內酰胺酶，該酶以β-內酰胺環為底物，使青霉素類抗生素的抗菌作用減弱。25.2×10⁶。的耐四環素質粒和24.5×10⁶的結合型質粒可能與介導四環素高水平耐藥有關。25.2×10⁶質粒帶有tetM決定簇，tetM基因所編碼的胞質蛋白能夠抑制四環素類藥物對細菌核糖體的毒性作用，使淋病奈瑟菌對四環素類藥物產生高度耐藥。帶有該基因的質粒不僅能在淋病奈瑟菌間進行傳遞，還可以在多種革蘭陽性和陰性細菌間傳遞，從而產生多重耐藥和交叉感染 。

 

5 erm基因的出現引起阿奇霉素耐藥

近年出現了淋病奈瑟菌對阿奇霉素耐藥的現象，其原因可能為erm基因的出現。erm基因編碼erm酶，此酶可使rRNA自動甲基化，引起阿奇霉素類抗生素的作用靶位——核糖體50S亞基蛋白發生改變，降低50S亞基蛋白與阿奇霉素類藥物的親和力，導致阿奇霉素類抗生素耐藥性的產生。

 

6 spe位點的突變引起大觀霉素耐藥

臨床上耐大觀霉素類淋病奈瑟菌株少見，但近年也出現了淋病奈瑟菌耐大觀霉素的報道。研究表明，其耐藥機制可能是淋病奈瑟菌染色體上spe位點突變，使其編碼的30S核糖體亞單位結構出現改變，從而降低了大觀霉素類抗生素與淋病奈瑟菌的親和力。

 

綜上所述，淋病奈瑟菌對抗生素的耐藥情況日益嚴峻，對青霉素、四環素、喹諾酮等藥物已基本上全部耐藥，對現今一線藥物大觀霉素類抗生素也逐漸出現耐藥菌株，隨著抗生素的廣泛使用，耐藥情況會越來越嚴重，因此要加強淋病奈瑟菌耐藥性的研究，并根據其耐藥機制對淋病奈瑟菌進行針對性處理，如改變淋病奈瑟菌的耐藥基因序列，消除耐藥質粒；臨床上根據耐藥機制的不同采取不同的給藥措施，如對于penA和ponA改變的菌株，可用喹諾酮類藥物進行治療；對于主動外排機制引起的耐藥菌株，可應用能量抑制劑抑制其外排蛋白的主動轉運等，以此來降低淋病奈瑟菌耐藥性的發生。因此，科研上應著力研究淋病奈瑟菌耐藥性產生的機制，尤其是在分子水平上進行研究，以期能夠研究出解決淋病奈瑟菌耐藥的方法，并為今后抗生素的研制提供合理依據。

 

(劉蓉華，張雷，淋病奈瑟菌耐藥性與耐藥基因的研究進展[J]醫學綜述2011年7月第17卷第13期：2024-2026)

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