ZD1839(Iressa)的基礎(chǔ)研究

　　在很多人類腫瘤中都存在著表皮生長因子受體（EGFR）和c-erbB2的過表達(dá)，研究表明，它們與腫瘤的侵略行為和患者的不良預(yù)后有關(guān)。EGFR酪氨酸激酶家族起到把細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的作用，增加了腫瘤細(xì)胞的增殖，阻止凋亡，增強(qiáng)了其活性、粘附性和侵襲性，其中最重要的是由原癌基因c-erbB-1/HER-1/EGFR和c-erbB-2/her2/neu編碼的EGFR[1]，針對EGFR和它的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶向治療能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成和DNA損傷修復(fù)。ZD 1839是一種高特異性的EGF受體酪氨酸激酶抑制劑，阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一步，抑制了EGFR磷酸化作用，而有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[2]，與放療和化療聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同作用。

    1 表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）的作用機(jī)理

    1.1 EGFR的結(jié)構(gòu)與功能 EGFR是一個分子量為17kDa的跨膜糖蛋白，有配體依賴性的酪氨酸激酶活性，除造血干細(xì)胞外，存在于大多數(shù)細(xì)胞中，在多種腫瘤中都有過表達(dá)，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌等，其中NSCLC的鱗狀細(xì)胞癌表達(dá)率最高為57％～92％[3]。EGFR由3個主要區(qū)域組成：一個N端細(xì)胞外區(qū)域，一個疏水的跨膜區(qū)和一個C端細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，細(xì)胞內(nèi)包括酪氨酸區(qū)域。細(xì)胞外區(qū)域是多種多肽生長因子的配體結(jié)合點(diǎn)，其中最重要的是表皮生長因子（EGF）和轉(zhuǎn)移生長因子α（TGFα）[4]。細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)與EGF和TGFα結(jié)合后，發(fā)生受體二聚合，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域被激活，與一個ATP分子結(jié)合，受體自身磷酸化和其他受體單體的脫磷酸化。自體磷酸化把磷酸鹽并入C-末端殘基的酪氨酸中，使其成為一些包括信號傳導(dǎo)體（如p85，Grb2/Sos，PLCγ1等）的Src同源體2（SH2），它的作用是把增殖和生存信號傳導(dǎo)到受體的下游信號傳導(dǎo)途徑中[5]。在配體誘導(dǎo)的激活后，EGFR能連接很多參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)瀑布反應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，包括PLCγ、PI3K、小G蛋白、p21 Ras、GAP和Src家族激酶[6,7]，通過不同的受體類型和磷酸化結(jié)合的位點(diǎn)，使不同的信號蛋白被激活。這個過程使不同的細(xì)胞外信號被傳導(dǎo)到細(xì)胞核中。EGFR的酪氨酸激酶活性代表了它的有效結(jié)構(gòu)，并且是信號傳導(dǎo)的基礎(chǔ)，細(xì)胞能通過生長因子自體分泌方式發(fā)生自身惡變，而為了獲得惡性轉(zhuǎn)變，需要活性配體的存在和EGFR的高水平表達(dá)[8]。除了促增殖外，活化的EGFR對腫瘤發(fā)展起重要作用的生物學(xué)反應(yīng)還包括：對細(xì)胞運(yùn)動性的影響、細(xì)胞粘附、浸潤、細(xì)胞生存和血管生成[9]。

    1.2 抗腫瘤治療的新靶向 由于EGFR酪氨酸激酶在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)活性，因此它已經(jīng)成為抗腫瘤治療的新靶向。酪氨酸激酶磷酸化抑制劑作用在細(xì)胞內(nèi)受體區(qū)域，通常被稱為TKIs，大多數(shù)是完全占據(jù)ATP結(jié)合位點(diǎn)，因而對EGFR酪氨酸激酶有很好的選擇性。4-苯胺奎哪唑啉是一種與ATP位點(diǎn)結(jié)合的有效和選擇性的抑制劑。這類藥物的結(jié)構(gòu)—活性關(guān)系清楚定義了其結(jié)合方式，奎唑啉環(huán)與腺嘌呤結(jié)合，苯胺環(huán)與鄰近的單一的親脂區(qū)結(jié)合。一個單獨(dú)的鄰近奎唑啉結(jié)合位點(diǎn)的半胱氨酸(Cys-773)導(dǎo)致了不可逆的抑制作用[10]。其中的代表為口服藥ZD1839">ZD1839（商品名為Iressa）。ZD1839是一種口服的有活性、選擇性和可逆性的表皮生長因子受體（EGRF）酪氨酸激酶抑制劑，它阻斷了在腫瘤細(xì)胞增殖和生存中包含的信號傳導(dǎo)途徑。

    1.3 ZD1839的藥物代謝動力學(xué) ZD1839是有效的EGFR-TKI（IC(50) = 0.033 micro M），口服給藥，一天一次，對腫瘤生長的抑制呈劑量依賴形式，并且腫瘤異種移植物EGFR的表達(dá)水平并不影響對ZD1839的敏感性[11]。健康志愿者（28名）的藥物代謝動力學(xué)的研究結(jié)果顯示單一口服ZD1839后，血漿藥物濃度峰值（Cmax）出現(xiàn)在3～7小時，Cmax隨后成雙向下降，半衰期介于27和41小時之間，劑量范圍在10mg～100mg之間，Cmax及AUC24h（0到24小時曲線下面積）和劑量之間呈線性上升關(guān)系[12]。

    2 人類腫瘤細(xì)胞系和動物模型中的研究

    通過人類腫瘤細(xì)胞系和無胸腺裸鼠人類腫瘤異種移植物模型對ZD1839的研究可以證實(shí)其具有抗增殖、抗血管生成和增加凋亡的作用。Ciardiello等[13]評估了ZD1839在共同表達(dá)TGFα和EGFR的人類結(jié)腸（GEO，SW480和CaCo2）、乳腺（ZR-75-1，MCF-7 ADR）、卵巢（OVCAR-3）和胃（KATO III 和N87）的癌細(xì)胞系中的抗血管生成和抗腫瘤作用，GEO異種移植的免疫缺陷鼠，在ZD1839治療后，用免疫組化分析GEO異種移植物顯示了腫瘤細(xì)胞中TGFα、bFGF和VEGF的表達(dá)下降呈明顯的劑量依賴性，由微血管計(jì)數(shù)測定的抗新血管生成作用亦有劑量依賴性。英國一個試驗(yàn)組[14]在對原位導(dǎo)管癌（Ductal carcinoma in situ，DCIS）的異種移植物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，口服ZD1839（100～200 mg/kg，共14 天）使上皮細(xì)胞增殖降低了56％。Anderson NG等[15]觀察到在體外，EGFR過表達(dá)的A431和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系的增殖在給予ZD1839最大有效劑量的一半時就有50％～70％被抑制，抑制了20％～80％EGFR（＋）erbB2過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞（SKBr3、SKOV3、BT474）的增殖， ZD1839抑制了無胸腺裸鼠異種移植MDA-MB-231和SKOV3腫瘤的生長，分別為71％和32％。

    2.1 ZD1839與細(xì)胞毒藥物聯(lián)合應(yīng)用的研究 ZD1839與多種細(xì)胞毒藥物化療聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同的抗腫瘤活性，這種抑制作用不僅見于進(jìn)展期轉(zhuǎn)移的腫瘤，還見于早期病灶，如人類乳腺導(dǎo)管原位癌。Magne等[16]在CA133細(xì)胞系（一種高表達(dá)EGFR的人類頭頸部癌細(xì)胞系）中先加入ZD1839孵育48小時，再加入順鉑和5-Fu孵育48小時。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZD1839單藥誘導(dǎo)細(xì)胞聚集于G0/G1期，在24小時p21、p27 和Bax表達(dá)增高，Bcl2表達(dá)和Akt磷酸化明顯降低。48小時時DNA-PK降低。ZD1839單獨(dú)應(yīng)用對caspase-3活性沒有影響，但是與順鉑/5-Fu聯(lián)合應(yīng)用時在96小時出現(xiàn)caspase-3的明顯增高。

    實(shí)驗(yàn)證實(shí)在GEO異種移植物模型中，細(xì)胞毒藥物PTX聯(lián)合應(yīng)用ZD1839抗癌活性增加[13]。觀察到所有聯(lián)合應(yīng)用ZD1839和PTX治療的小鼠腫瘤全部都有縮小，并且有對TGFα、VEGF和 bFGF 表達(dá)的抑制作用明顯加強(qiáng)，很少伴有或不伴有微小血管形成。并且16只GEO異種移植鼠中有6只在聯(lián)合應(yīng)用ZD1839和PTX治療后最終均未出現(xiàn)GEO腫瘤組織學(xué)證據(jù)。這些結(jié)果說明ZD1839的抗腫瘤效果伴隨有對自分泌和旁分泌生長因子TGFα、VEGF和 bFGF的抑制，而這些生長因子維持促進(jìn)了局部組織的生長和新血管的生成。意大利一個研究組[17]對表達(dá)EGFR的人類卵巢癌（OVCAR-3）、乳腺癌（ZR-75-1，MCF-10A ras）和結(jié)腸癌（GEO）細(xì)胞系給予ZD1839聯(lián)合細(xì)胞毒藥物（順鉑、卡鉑、草酸鉑、紫杉醇、多西紫杉醇、表阿霉素、依托泊甙、拓?fù)涮婵岛蛂altitrexed）進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)ZD1839聯(lián)合任一種化療藥均有協(xié)同抑制細(xì)胞生長的作用。同時對GEO異種移植的裸鼠，用2.5mgZD1839聯(lián)合紫杉醇、拓?fù)涮婵岛蛂altitrexed治療，在治療的第4周末，和未治療或單藥治療組比較，對腫瘤的生長有明顯的抑制作用（P=0.01）。美國的一個腫瘤中心[18]研究了對小細(xì)胞肺癌（LX-1）、非小細(xì)胞肺癌（A549，SK-LC-16）、前列腺癌（PC-3，TSU-PR1）的異種移植物聯(lián)合應(yīng)用ZD1839和鉑類化療藥、紫杉醇、阿霉素和edatrexade治療，證實(shí)ZD1839能提高這些細(xì)胞毒藥物的抗腫瘤作用，并且ZD1839抗腫瘤活性的提高并不要求這些腫瘤EGFR水平的高表達(dá)，提示對沒有EGFR高水平表達(dá)的腫瘤，應(yīng)用ZD1839聯(lián)合細(xì)胞毒藥物有很大的臨床潛力。

    2.2 ZD1839與放療聯(lián)合應(yīng)用的研究 EGFR的表達(dá)與腫瘤的放療抵抗相關(guān)。最近證實(shí)EGFR信號傳導(dǎo)在體外能增加放療后細(xì)胞的增殖[13]，并有人認(rèn)為腫瘤細(xì)胞放療后的修復(fù)部分是由于放療后EGFR信號激活所致[19]。應(yīng)用ZD1839可以抑制放療后腫瘤的生長，提高放療敏感性，增加治療反應(yīng)。在人類頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的體外和移植物模型中應(yīng)用ZD1839與放療聯(lián)合治療[20]，證實(shí)ZD1839明顯提高了放療反應(yīng)，腫瘤抑制作用增強(qiáng)并且延緩了腫瘤的再生長和復(fù)發(fā)。Wlilliams等[21]在體外將LoVo細(xì)胞系（人類結(jié)腸癌細(xì)胞系）與ZD1839（0.5 microM）孵育1～5天后，分割放療（2 Gyday(-1), days1-3）的抗增殖效應(yīng)明顯提高 （P=0.002）。對裸鼠LoVo人類結(jié)腸癌異種移植物模型研究了單劑量放療（5Gy）及分割放療（2Gy×5次）聯(lián)合應(yīng)用ZD1839對腫瘤的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不論是單劑量放療還是分割放療，聯(lián)合ZD1839，對腫瘤的生長抑制作用均增強(qiáng)（P≤0.001），而以分割形式放療ZD1839的放療增敏作用更明顯，可能是由于放療分割間期中ZD1839對再增殖細(xì)胞的抗增殖效應(yīng)。

    Shintani S等[22]對5個頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）細(xì)胞系（HSC2, HSC3, HSC4, SCC25 and Ca9-22）測定了EGFR表達(dá)水平與放療敏感性的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些HNSCC細(xì)胞系的放療敏感性差異很大，并且EGFR的表達(dá)也不同，EGFR 表達(dá)水平（EGFR numbers/cell）與腫瘤對放療抵抗增加有關(guān)（f[x]= 4.54 X, R2 = 0.715；f[x]: EGFR numbers/cell, X: radiosensitivity; D10）。1.0 microM ZD1839 聯(lián)合放療(0～10 Gy)時，HNSCC細(xì)胞系的生長抑制作用增強(qiáng)，ZD1839可以改善腫瘤細(xì)胞對放療的反應(yīng)。Magne N 等[23]對6個頭頸部細(xì)胞系研究了放療聯(lián)合ZD1839治療的細(xì)胞毒效應(yīng)，認(rèn)為在放療前給予ZD1839可以獲得最好的效果(P=0.002)。

    Bianco 等[24]在ZD1839聯(lián)合放療在人類結(jié)腸癌（GEO）、卵巢癌（OVCAR-3）、非小細(xì)胞肺癌（A549和Calu-6）和乳腺癌（MCF-7 ADR）細(xì)胞系中都觀察到了劑量依賴性生長抑制。電離輻射后給予ZD1839，觀察到有抗增殖和促凋亡效應(yīng)，并伴有抗凋亡蛋白bcl-xL和bcl-2表達(dá)和Akt蛋白的磷酸化形式的抑制。GEO異種移植物接受RT也為劑量依賴性生長抑制，這種抑制作用在治療終止后可以逆轉(zhuǎn)。RT聯(lián)合ZD1839后有長期的GEO腫瘤生長抑制。聯(lián)合治療組小鼠的生存期同對照組相比（P < 0.001），同RT治療組相比（P < 0.001）, 或同ZD1839治療組相比（P < 0.001）均明顯延長。只有聯(lián)合RT和ZD1839治療組的小鼠生存達(dá)10周，并有10%的小鼠在26周后仍為無病生存。RT與ZD1839聯(lián)合應(yīng)用還伴隨有TGFα、BEFG和bFGF在細(xì)胞表達(dá)的明顯抑制，這導(dǎo)致GEO腫瘤中的抗血管生成作用。

    Solomon等[25]發(fā)現(xiàn)體外A431（過表達(dá)EGFR的人類陰道鱗狀細(xì)胞系）放療后應(yīng)用ZD1839，細(xì)胞增殖減少，凋亡增加并且生存期縮短。A431異種移植物無胸腺裸鼠（100 mm3）接受10Gy單次分割或4天每天2.5 Gy分割放療，聯(lián)合或不聯(lián)合ZD1839（75 mg/kg/d 腹腔給藥10天）時對腫瘤生長的抑制效應(yīng)。結(jié)果顯示不論10Gy（提高比1.5）單次分割或是4天每天2.5 Gy分割放療（提高比4）聯(lián)合應(yīng)用ZD1839后對腫瘤生長的延遲都有更強(qiáng)的效應(yīng)。ZD1839 減少了腫瘤的血管分布，以及有EGF誘導(dǎo)的VEGF蛋白和mRNA的水平，提示有抑制血管生成的作用。用ZD1839抑制EGFR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑可以加強(qiáng)單分割和多分割放療效果的作用。

    She Y 等[26]也證實(shí)了ZD1839可以明顯提高放療的抗腫瘤活性。人類非小細(xì)胞肺癌（A549和SK-LC-16）和乳腺癌（MDA-MB468）和人類間皮瘤（JMN）模型中，當(dāng)腫瘤達(dá)到0.4mm～0.6 mm后，開始予ZD1839的最大耐受劑量（MTD） (150 mg/kg ，每天1次×5天，連續(xù)2周)，RT(總劑量40 Gy，分割放療4 Gy/天×5 天，連續(xù)2周)及ZD1839與RT聯(lián)合治療。結(jié)果顯示單獨(dú)給予ZD1839一種腫瘤生長35％～40%，RT抑制18％～72%，聯(lián)合治療抑制50％～99%，并且聯(lián)合應(yīng)用并未增加毒性。

    3 總結(jié)與展望

    ZD1839是一種口服有活性和選擇性的EGFR-TKI，阻斷信號傳導(dǎo)途徑，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成，它的基礎(chǔ)研究已經(jīng)證實(shí)ZD1839對多種腫瘤有抗腫瘤活性，不論是間斷給藥還是持續(xù)給藥，都具有很好的耐受性。在細(xì)胞系和異種移植物的研究中已經(jīng)證實(shí)ZD1839同放療或化療聯(lián)合應(yīng)用具有附加的協(xié)同作用，可以提供抗腫瘤活性，為進(jìn)一步聯(lián)合治療的臨床試驗(yàn)提供了理論依據(jù)。

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