四氫生物蝶呤與葉酸對(duì)高脂血癥兔尿蝶呤的影響

　　許多心血管疾病都與一氧化氮（Nitric Oxide，NO）活性低下或生成不足有關(guān)，如動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓病、心肌缺血再灌注、心力衰竭等。已有動(dòng)物研究表明 ［1，2］ ，四氫生物蝶呤作為一氧化氮合酶的重要輔助因子，參與NO的合成。外源性補(bǔ)充可減少各種氧自由基的產(chǎn)生，降低脂質(zhì)過氧化的水平，從而延緩并減少心腦血管疾病的發(fā)生及進(jìn)展。但BH 4 的價(jià)格昂貴，使其臨床應(yīng)用受到限制。研究已明確葉酸與四氫生物生物蝶呤系類似物 ［3］ ，本研究旨在觀察FH 4 是否可以提高實(shí)驗(yàn)性高膽固醇血癥兔組織內(nèi)的BH 4 含量，以探討FH4的作用機(jī)制及價(jià)廉的BH 4 取代FH 4 的可行性。本實(shí)驗(yàn)采用常用的尿液蝶呤分析來檢測BH 4 含量。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選取純種新西蘭大白兔（青島市動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量2.0～2.25kg，雄雌不限）24只，隨機(jī)分成4組（n=6）。在適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段。A組進(jìn)食普通飼料，其余各組進(jìn)食高脂飼料。B組為模型組，C組為BH 4 干預(yù)組，D組為葉酸干預(yù)組。高脂飼料的配方為:1%膽固醇，8%豬油，75%蛋黃粉，83.5%普通顆粒飼料。限食量，每兔每日250g，分籠喂養(yǎng)，共喂養(yǎng)60d。每半月測體重一次。C組同時(shí)給予BH 4 2mg/（kg·d），溶解在食用水中，與水同飲;D組同時(shí)給予葉酸2mg/（kg·d），溶解在食用水中，與水同飲。

　　1.2 標(biāo)本采集及處理 所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物喂養(yǎng)60d后，取耳緣靜脈血2ml，室溫下放置15min，4000r/min離心15min，取血清，分裝編號(hào)。測定血清總膽固醇（TC）含量。同時(shí)，抽取膀胱尿液5ml，馬上加入維生素C（20mg/ml urine），避光下混合均勻后分裝于避光容器中，冷凍在-80℃待分析。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;P<0.01差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié)果

　　2.1 各組血清TC含量測定結(jié)果 見表1。

　　表1 各組血清TC含量 （略）

　　注:與A組比較， △ P<0.01

　　表1說明，與正常飲食組相比較，其它各組的膽固醇明顯升高，差異有非常顯著性（P<0.01），BH 4 組與FH 4 組的膽固醇雖低于模型組，但差異無顯著性。高膽固醇血癥兔的模型已建立成功。

　　2.2 各組尿樣中生物蝶呤測定結(jié)果 見表2。

　　表2 各組樣品中尿蝶呤含量 （略）

　　注:與B組比較， △ P<0.05

　　表2說明，模型組與其它各組比較，新蝶呤升高而生物蝶呤下降，差異有顯著性，P<0.05。

　　3 討論

　　近年來，一氧化氮（Nitric Oxide，NO）及一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）的關(guān)系及其生理功能受到了人們的廣泛關(guān)注。由NOS合成的NO具有多種生理和病理作用，可使血管平滑肌舒張，抑制白細(xì)胞粘附于內(nèi)皮細(xì)胞上，抑制血小板與血管壁間的相互作用，以及抑制血管平滑肌細(xì)胞的增生和損傷。

　　實(shí)驗(yàn)表明 ［4］ 細(xì)胞內(nèi)BH 4 水平?jīng)Q定了結(jié)構(gòu)型一氧化 氮合酶（constitutive NOS，cNOS）是產(chǎn)生NO或超氧化物，并調(diào)節(jié)著二者的平衡。此外，BH 4 還可降低次黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生超氧化物的能力，具有直接的抗氧化作用，減少組織、細(xì)胞的氧化損傷。因此，BH 4 在維持正常血管反應(yīng)過程中具有重要的生理學(xué)意義。

　　高脂造成BH 4 含量絕對(duì)或相對(duì)減低可能的原因是:（1）脂質(zhì)過氧化物及氧自由基生成增多造成細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài) ［5］ ，而BH 4 在細(xì)胞內(nèi)的合成有賴于正常的氧化還原環(huán)境;（2）NOS活性上調(diào)，導(dǎo)致BH 4 活性相對(duì)降低。

　　葉酸與BH 4 為類似物，兩者結(jié)構(gòu)相似，參與的遞氫、遞甲基反應(yīng)相似，催化的酶亦相同 ［3］ 。Hyndˉman ME ［6］ 等證實(shí)葉酸與BH 4 的作用靶位相似，它可直接作用于NOS提升NO的產(chǎn)量和促進(jìn)內(nèi)皮功能。另外，葉酸尚可提高BH 4 的生物利用度，刺激內(nèi)源性BH 4 的再生 ［7］ 。葉酸在細(xì)胞內(nèi)很易被還原為甲基四氫葉酸，后者是前者在循環(huán)系統(tǒng)的主要活性形式，甲基四氫葉酸是同型半胱氨酸（Hcy）降解途徑中重新合成蛋氨酸的甲基供體，由此可降低Hcy的濃度。葉酸缺乏導(dǎo)致代謝通路受阻，血中Hcy累積，成為高Hcy血癥。研究發(fā)現(xiàn)，Hcy可在金屬離子介導(dǎo)下，自身氧化生成過氧化物及氧自由基，損傷內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，降低了內(nèi)皮依賴性舒張因子-NO的生物活性 ［8，9］ ，并提高了血液凝固性，從而啟動(dòng)了粥樣硬化斑塊形成。有報(bào)道 ［6］證明足量的葉酸可優(yōu)化NOS的活力、防止硝酸酯類藥物的耐受。從而保護(hù)血管內(nèi)皮，延緩心腦血管疾病的進(jìn)展。

　　BH 4 缺乏癥最常見是由于BH 4 合成代謝途徑中的合成酶6-丙酮酰四氫蝶呤（PTPS）缺乏所致 ［10］ ，也可因二氫生物蝶呤還原酶（DHPR）活性降低所致，DHPR活性降低的病人體內(nèi)往往積聚大量的FH 2 ，Smith I等 ［11］ 報(bào)道用大劑量的葉酸可促進(jìn)FH 2 向FH 4 轉(zhuǎn)化，從而提高細(xì)胞內(nèi)的FH 4 水平。當(dāng)因PTPS缺乏導(dǎo)致下降時(shí)，尿新蝶呤（neopterin，N）明顯增加，生物蝶呤（biopterin，B）明顯降低，N/B增高。尿蝶呤分析是評(píng)定BH 4 的有效的診斷方法，隨著蝶呤檢測技術(shù)的發(fā)展，目前，國外越來越傾向直接檢測血漿中生物蝶呤、尿蝶呤及BH 4 的濃度，該檢測對(duì)設(shè)備及技術(shù)要求較高 ［12］ 。本實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)數(shù)字表明:高脂飲食導(dǎo)致生物蝶呤明顯降低，而新蝶呤則明顯升高，與正常飲食組相比較，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但在葉酸及BH 4 的干預(yù)下，生物蝶呤及新蝶呤均可恢復(fù)，兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明葉酸與BH 4 相似，均可提高細(xì)胞的BH 4 含量。

　　目前，葉酸改善內(nèi)皮功能的機(jī)制目前傾向于以下幾種觀點(diǎn) ［11，13］ :（1）增加BH 4 從醌型BH 2 再生，對(duì)于BH 2 積聚的患者，用葉酸的代謝進(jìn)行干預(yù)，可提高BH 4 的水平;（2）可能作為NO合成的電子供體或蝶呤還原酶;（3）減少同型半胱氨酸的產(chǎn)生;（4）加強(qiáng)BH 4 與eNOS結(jié)合;（5）提高BH 4 的生物利用度;（6）直接的抗自由基作用。本實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)H 4 與BH 4 均無明顯降低血清總膽固醇的作用，說明FH 4 與BH 4 對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用并不依賴于降低血脂。葉酸干預(yù)組同BH 4 干預(yù)組相似，均可明顯升高尿蝶呤，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持上述觀點(diǎn)，提示外源性補(bǔ)充葉酸可提高高膽固醇血癥兔組織內(nèi)BH 4 的水平，從而保護(hù)血管內(nèi)皮功能減少心血管事件的發(fā)生。為心血管疾病的防治尋求新的適合我國國情的治療途徑。國外對(duì)此研究已在臨床開展，而國內(nèi)的研究尚需加強(qiáng)。（參考來源：四氫生物蝶呤與葉酸對(duì)高脂血癥兔尿蝶呤的影響，陸偉，中華現(xiàn)代內(nèi)科學(xué)雜志2005年第2卷第1期）

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