脂康調節高脂血癥家兔肝臟LDL-R mRNA水平的實驗研究

　　高血脂能導致冠狀血管等全身血管的不同程度硬化，導致各種臨床并發癥。目前治療血脂異常、動脈硬化的西藥雖然在臨床取得了一定的療效，但同時其對肝、腎功能會產生一定的影響，不利于長期服用。研制毒副作用小，療效顯著、具有多靶點綜合治療效應的中藥復方制劑，是目前中醫臨床研究的一個熱點。中藥脂康由黃芪、沙棘、山楂、紅花、丹參、三七粉等組成，具有健脾益氣、祛痰降濁、調整陰陽氣血和臟腑功能、活血化瘀之功效，適用于高脂血癥及輕中型冠心病，在臨床上應用數年，對高脂血癥及動脈硬化的防治上已取得了很好的療效。脂康通過清除人體內的痰濁、瘀血等有害物質，抑制脂質合成，促進脂質的轉運和清除，加速脂質排泄等多種途徑調節血脂。本實驗主要從基因水平上研究脂康對高脂血癥家兔肝臟低密度脂蛋白受體基因表達的調節作用，從而探討脂康調節血脂的主要機理。

　　1 材料與方法

　　1.1 脂康方藥的制備 本處方由沙棘、山楂、丹參、紅花、黃芪、三七等為主組成。經醇提、水提、干燥后制成丸劑，每丸0.5g。等臨床劑量按人和動物體表面積換算，相當于60kg體重人每日的藥量。

　　1.2 實驗動物造模及用藥方法 純種新西蘭大耳白兔60 只，體重1.9～2.1kg,兔齡4個月，隨機選取10只為正常組，喂飼普通顆粒飼料，150g／d，其余50只給予高脂飼料（1％膽固醇、5％蛋黃粉、5％豬油、89％普通飼料）喂飼，150g／d 。于第4周末根據膽固醇情況隨機分為5組，每組 10只：模型對照組給予高脂飼料喂飼，150g/d；其余用藥組除給予高脂飼料喂飼150g/d外，脂康低劑量組給予脂康浸膏0.2 g /（kg·d）；脂康高劑量組給予脂康浸膏0.4 g /（kg·d）；血脂康對照組給予血脂康0.1g/（kg·d）；辛伐他汀對照組給予辛伐他汀0.8mg/ （kg·d）。

　　喂飼8周后，麻醉，心臟取血，用于血脂項目檢測。取靠近肝門靜脈處的肝臟組織，直徑約2cm，用濃度10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，用光鏡觀察。另取肝臟組織，直徑約1cm，用濃度4%的多聚甲醛固定后做LDL-R mRNA（原位雜交）檢測。

　　1.3 生化指標檢測 分別于用藥前取耳緣靜脈血及用藥后心臟取血10ml，離心3000r/min，10min，取血清分裝，－20℃冰箱保存，血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量測定采用酶法，根據Friedward公式法計算低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，即LDL-C=TC-（TG/2.2+HDL-C)。動脈硬化指數（AIP）為TG與HDL-C摩爾濃度比值的對數。血脂檢測試劑盒（北京中生生物工程高技術公司生產）。

　　1.4 肝臟組織LDL-R mRNA原位雜交檢測 （LDLR ISH 原位雜交試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司提供）。

　　1.4．1 實驗步驟 (1)將新鮮的肝組織切成不超過4mm的小塊，并及時用固定液固定1h。(2)常規脫水、浸蠟、包埋，切片厚度為6～8μm。(3)石蠟切片經常規二甲苯、乙醇脫蠟，滴加H202，室溫5～10min以滅活內源性酶。(4)暴露mRNA核酸片段:切片上加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶。37℃ 12～15min，清洗。(5)后固定:胃蛋白酶消化后在玻片上滴加固定液室溫固定10min，清洗3次。(6)預雜交:首先將濕盒準備好，每張切片滴加20μl預雜交液，放入濕盒內， 38℃～42℃ 4h，甩去多余的液體。(7)雜交:在每張玻片上滴加20μl雜交液，將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上。放恒溫箱雜交過夜。(8)雜交后洗滌。 (9)滴加封閉液:放入37℃ 30min后取出，甩去多余液體，不洗。(10)滴加生物素化鼠抗地高辛:放入37℃ 60min，PBS洗滌。(11)滴加SABC:放入37℃ 30min， PBS洗滌。(12)滴加生物素化過氧化物酶:37℃恒溫箱中放置30min，PBS洗滌。(13)DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒，滴至玻片上，顯色30～50min，充分水洗，蘇木素復染，充分水洗，酒精脫水，二甲苯透明，封片。

　　1.4．2 原位雜交實驗結果判定 光學顯微鏡下觀察結果的判定標準:原位雜交結果以細胞漿內或核膜上出現棕黃色顆粒者或斑片為陽性細胞。

　　1.4．3 分析方法和統計學處理 計算機圖像分析，在圖像卡IBM586和Olympus BX60顯微鏡組成的圖像處理系統上，測定陽性細胞數:每組每只大鼠各5個高倍視野(10×40)下原位雜交陽性細胞率(%)。

　　1.5 結果統計 計量資料采用單因素方差分析，F檢驗，結果用均數和標準差(x±s)表示。用SPSS10.0統計軟件對結果進行統計。

　　2 實驗結果

　　2.1 血脂水平變化 本實驗結果提示脂康高劑量組對高脂血癥家兔血清TC、TG、LDL-C水平有顯著的降低作用（P<0.01），對HDL-C有顯著升高作用（P<0.01）。脂康高劑量與西藥辛伐他汀比較，在降低家兔血清TC、TG、LDL-C的作用相近，升高HDL-C作用優于辛伐他汀；與中藥血脂康比較，在降低家兔血清TC、LDL-C的作用明顯優于血脂康，降低TG水平作用相近，升高HDL-C水平作用優于血脂康。

　　2.2 肝臟LDL-R mRNA水平變化 肝臟LDL-R mRNA的陽性表達信號可見細胞漿內出現棕黃色顆粒，應用圖像分析系統計算各組的陽性表達率，結果見表1。

　　正常對照組與模型對照組、脂康高劑量組及辛伐他汀對照組比較差異有顯著性(P<0.01),模型對照組明顯低于其他各組，比較差異有顯著性(P<0.01), 脂康高劑量組明顯高于其余各組。

　　表1 肝臟LDL-R mRNA水平變化 (略)

　　3 討論

　　本研究利用核酸原位雜交法觀察脂康對高脂血癥兔肝細胞LDL-R基因表達的影響。研究結果表明，模型組高膽固醇兔肝細胞LDL-R mRNA表達水平與正常組相比明顯降低，而當高膽固醇兔給予脂康和相關藥物后，其肝細胞的LDL-R mRNA表達水平又明顯提高，尤其是高劑量脂康組最為明顯。可見，脂康有顯著激發、上調高血脂兔肝臟細胞LDL-R基因表達的效應，從分子水平上能有效地調節脂質代謝作用。

　　近年來，國內外學者對LDL受體的功能從生化、免疫、遺傳等方面做了大量研究，認為血漿中2/3以上的LDL是通過肝臟LDL受體途徑降解的，其基因表達異常可影響LDL的清除，使血中LDL水平升高，導致高脂血癥、動脈粥樣硬化［1］。正常情況下，細胞LDL受體的數量決定血循環中LDL被清除的速度。細胞內含膽固醇含量的多少反饋地控制著LDL受體的合成［2］。當細胞處于高膽固醇負荷時，可下行抑制LDL-R基因的轉錄，使其表達下降，LDL-R數目減少［3］。反之亦然。細胞漿中的游離膽固醇及其氧化產物（如7-羥膽固醇、25-羥膽固醇）通過調控LDL受體基因的轉錄，調節細胞內LDL-R合成，進而影響細胞攝取LDL，當細胞內游離膽固醇及其氧化產物含量增高時，LDL-R基因轉錄水平下降，抑制細胞LDL-R蛋白質的合成，細胞膜LDL-R的數量下降，減少細胞對LDL的進一步攝取。反之，則LDL-R基因反饋性轉錄增強，細胞合成LDL受體增加，促進細胞攝取LDL，促進膽固醇的攝入［4］。

　　脂康提高LDL-R基因表達的可能機理是：AS的病理基礎主要是肝脾失調，而痰瘀是其病變之標，脂康通過理脾，增強了脾的主動運化功能，而脾的正常運化、升清降濁又促進了肝的正常疏泄。因此在治療時以調脾為主同時注意調肝、疏肝，從整體上改善了機體代謝環境，加強了機體代謝機能，顯著降低了血清TC、LDL-C水平。LDL-R基因啟動子5’區域存在著膽固醇調節單位I( sterol regulatory ele ment I,SRE-I)［5］，當細胞膽固醇降低時可促進LDL-R基因表達，為激活肝臟細胞膜LDL-R基因表達創造了條件。從實驗結果看，治療組肝臟細胞的LDL-R基因表達強度顯著高于正常組，可能是在LDL-R基因表達的抑制解除后，LDL-R的活性大大增強，清除了LDL-C，又不斷促進LDL-R基因表達，加速了脂蛋白的分解。由于LDL-R的這種降解作用，使血中LDL-C更趨減少，從而使脂蛋白的代謝進入了良性循環。由于基因水平這一調控機制的存在，使細胞能夠保持膽固醇的精巧平衡。（參考來源：脂康調節高脂血癥家兔肝臟LDL-R mRNA水平的實驗研究，李曦明，中華醫學研究雜志2007年第7卷第3期）

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