乙肝病毒基因轉錄與復制的調控

 

                                  唐紅

                          轉自感染病學分會網站

 

　　乙型肝炎病毒（HBV）感染呈全球范圍廣泛流行。HBV感染可引起急性、慢性和重型肝炎，并與肝硬化、肝癌的發生密切相關，是嚴重危害人類健康的感染性疾病。雖然乙肝疫苗的成功應用使新發HBV感染有所下降，但目前HBV慢性感染者仍有3.5億人之多。由于HBV感染的致病和致癌變機理并不完全清楚，故目前尚缺乏特效的治療手段。

HBV屬嗜肝DNA病毒，通過逆轉錄機制復制。HBV基因組的轉錄是病毒復制過程中最關鍵的步驟，并受到精細的調控。因此，了解HBV轉錄和復制的調控機理，將有助于進一步澄清乙型肝炎的發病機理，并可為抗病毒治療提供可能的作用靶點，這對發展治療HBV感染的有效方法具有十分重要的意義。

 

一、HBV基因轉錄與病毒復制

　　HBV基因組全長3.2kb，具有四個啟動子和兩個增強子（EnhⅡ/Cp、PS1p、Sp和EnhⅠ/Xp），分別調控3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7kb HBV mRNA的轉錄，并進而編碼合成HBcAg、HBeAg、DNA多聚酶、HBsAg及HBxAg，且3.5kb前基因組RNA（pregenomic RNA）也是病毒逆轉錄復制的模板。

　　HBV的生活周期涉及病毒進入細胞，HBV DNA進入胞核形成cccDNA，HBV RNA轉錄，HBV DNA復制，HBV病毒的包裝、成熟和排泌等過程。HBV進入肝細胞后脫去核殼，HBV基因組DNA進入細胞核。首先，以負鏈DNA為模板延長正鏈并修補，封閉正鏈中的裂隙，形成共價閉合環狀DNA（cccDNA）。然后，以cccDNA為模板，在宿主RNA聚合酶的作用下轉錄生成上述幾種不同長短的RNA。其中，除編碼合成HBcAg、HBeAg和DNA多聚酶外，3.5kb前基因組RNA還具有一個重要功能，即作為病毒逆轉錄復制的模板。在病毒復制過程中，HBV DNA多聚酶結合于3.5kb前基因組mRNA 5’端ε莖–環結構，形成RNA/多聚酶復合物，并被核心抗原多肽二聚體包裹成未成熟的核殼體。在核殼體內的HBV DNA多聚酶催化下，以3.5kb前基因組RNA為模板，逆轉錄合成負鏈HBV DNA，然后再以負鏈DNA為模板合成正鏈HBV DNA。最終形成子代的不完全雙鏈環狀DNA。因此，HBV基因組（尤其是3.5kb前基因組）RNA轉錄的調控是病毒生活周期中至關重要的環節。

 

二、HBV基因轉錄的調控

　　HBV基因轉錄受多種泛嗜和肝富集轉錄因子的調控，也與病毒蛋白產物（如HBx）的調節作用相關。利用含HBV啟動子的報導基因體系，現已發現一系列對HBV啟動子具調控作用的順式調控序列和反式調控因子，可以通過調控HBV基因轉錄，從而影響病毒的復制。

3.5kb前基因組RNA的水平主要受存在于HBV基因組EnhⅠ/Xp和EnhⅡ/Cp區域的順式調節序列的調控。HBV EnhⅠ/Xp中現已證實的轉錄因子結合位點存在于核苷酸1000至1250位的區域，該區域位于HBV 3.5kb RNA轉錄起始位點的上游550-800位核苷酸處；能與EnhⅠ/Xp結合的轉錄因子包括C/EBP、P53、IRF、NF1、HNF3、HNF4、RXR、PPAR、COUPTF、RFX1、AP1、CREB和ATF2等。已發現的能與HBV Cp結合的轉錄因子有SP1、RFX1、C/EBP、FTF、HLF、E4BP4、HNF4、HNF3、RXR、PPAR、COUPTF1和ARP1等，其結合位點位于HBV前CRNA轉錄起始點上游（-180至-16）的區域。

　　在HBV RNA轉錄物中，3.5kb前基因組RNA是病毒DNA合成的模板，而病毒蛋白產物的水平則與各種HBV DNA轉錄物的水平相關。因此，HBV基因組的轉錄是病毒生物合成的主要調控步驟。研究顯示，若干種肝富集轉錄因子（如HNF1、HNF3、HNF4、RXRα、PPARα、HLR、FTF和C/EBP等）能與HBV的四個啟動子結合，對HBV的轉錄發揮重要調控作用。其中，位于EnhⅠ/Xp和EnhⅡ/Cp啟動子的HNF4結合位點同時也是RXR/PPAR的結合位點，是調控C啟動子活性及3.5kb mRNA轉錄的重要因子，在HBV高度組織特異性表達中可能具重要作用。而泛嗜轉錄因子如AP1、RFX1、NF1和SP1等對決定HBV啟動子活性和HBV轉錄水平也具重要的協同調節作用。

 

三、HBV基因轉錄對病毒復制的影響

　　在DNA病毒中，HBV具有非常獨特的復制機制，即其基因組首先要被轉變成RNA，然后再通過逆轉錄機制進行復制。病毒復制涉及3.5kb前基因組RNA（pgRNA）的合成、PgRNA包裝形成核殼體和逆轉錄合成HBV DNA等多個步驟。因此，HBV的復制涉及基因轉錄和基因轉錄后雙重水平，以及多個環節的調控作用。其中，由宿主RNA多聚酶Ⅱ催化合成前基因組RNA是HBV復制的起始步驟，并受HBV啟動子和增強子活性的影響。下面重點對我們近年來有關肝富集轉錄因子和HBx在HBV轉錄復制中的調控作用作一介紹：

 

1、肝富集轉錄因子在HBV嗜肝機理中的作用：

　　HBV感染的一個顯著特點是嗜肝性，闡明的HBV的嗜肝機理對乙型肝炎的發病機理及防治機理研究均具重要意義。我們應用于2001年建立的全新的HBV非肝源細胞復制體系的研究顯示，肝富集轉錄因子在HBV的肝特異性復制表達過程中起重要作用。其中，核激素受體HNF4和RXRα/PPARα通過與HBV基因組C啟動子結合而促使病毒前基因組RNA的合成，并支持HBV在非肝源細胞中的轉錄與復制，為HBV前基因組RNA合成和病毒復制所必需，是病毒嗜肝性的重要決定因素之一。而肝富集轉錄因子HNF3對核激素受體介導的HBV復制具抑制作用。提示HBV復制不僅取決于HNF4和RXRα/PPARα的水平，也與HNF3的相對水平和活性密切相關。從而揭示HBV的嗜肝機理涉及HBV感染進入細胞和HBV基因轉錄復制兩個水平的調控。

 

2、肝富集轉錄因子在病毒突變株篩選中的可能作用：

　　臨床上，部份乙肝患者雖發生血清HBeAg/抗-HBe轉換，但HBV DNA仍然陽性，這類病人通常伴有HBV前C區變異株的出現。一般認為，前C RNA和HBeAg合成減少所致的“免疫逃逸”是前C區變異株出現的重要原因。發生于HBV C啟動子A1764T和G1766A的核苷酸替代（稱TA變異）的變異株是臨床最常見的變異之一，該變異正好位于C啟動子遠端核激素受體結合位點中。利用肝癌和非肝癌HBV體外細胞培養系統我們發現，HNF4和RXRα/PPARα對野生株和該變異株HBV病毒的轉錄與復制具有不同的調節作用，改變HNF4和RXRα/PPARα的相對水平可能會選擇變異株的產生，提示肝富集轉錄因子對HBV轉錄復制的調控與抗病毒免疫過程中病毒變異株的產生相關。

 

3、HBV X蛋白可能通過調控HBV基因轉錄而影響HBV復制：

　　HBV X蛋白（HBx）是一個多功能調節蛋白，對基因轉錄、信號傳導、蛋白質降解、細胞周期和細胞凋亡等均具調節作用。HBx可能通過這些作用直接或間接調控HBV復制，并可能導致肝細胞癌變。利用HBV體外細胞培養和體內轉基因小鼠模型的研究顯示，HBx對HBV復制具有增強作用。既往多數研究認為，HBx對HBV復制的增強是通過轉錄后調節機制，如通過激活Ca2+離子通路或調節蛋白酶體活性而影響核殼體的形成和穩定性等。我們最近的研究顯示，HBx不僅增強HBV DNA復制，而且對3.5kb HBV RNA的轉錄也具激活作用，且對RNA轉錄的激活與DNA的增強作用密切相關。提示HBx對HBV的增強作用涉及HBV基因轉錄和轉錄后水平的雙重調節。

 

　　近年研究還顯示，許多免疫調節因子（如干擾素）也有可能通過調節HBV基因轉錄而影響HBV復制。此外，近年在HBV基因組中也發現了一些能夠影響HBV負鏈和正鏈合成的新的順式調節序列。

 

　　總之，HBV基因轉錄和病毒復制受多個層面、多種因素的調控和影響，近年的研究雖然取得了較大進展，但許多環節尚未完全明暸，值得進一步研究。對HBV基因轉錄與復制調控機理的深入研究，將有可能為抗HBV藥物的研發提供新的作用靶點。