類風濕關節炎免疫細胞變化的意義

    類風濕關節炎（rheumatiod arthritis，RA）的發病機制尚不明顯，目前較為認可的機制是機體內T細胞亞群和B細胞的失衡等免疫系統紊亂。近來有學者發現機體內存在著一群新型的不同于輔助性T細胞（TH）1、TH2、TH17及調節性T細胞等的CD T細胞亞群，由于該細胞亞群主要分泌白細胞就（IL）-9，所以將其命名為TH9，最近有學者提出該細胞可能與自身免疫病的發病機制有關。目前外周血中CD CD IL- 標記的TH9與自身免疫病的發病機制研究較少，本實驗旨在初步探討TH9細胞在RA發病中可能的作用。

    1 對象與方法
    1.1 研究對象
    選擇2011年1月至7月在安微醫科大學第一附屬醫院住院的36例RA患者，診斷均符合美國風濕病學會/歐洲抗風濕病聯盟（ACR/EULAR）2009年RA分類診斷標準的患者，其中男性7例，女性29例，年齡26~76歲，平均（56±14）歲，病程6個月至38年，平均（9±8）年。并收集患者的關節壓痛數、關節腫脹數、有無晨僵、關節畸形、功能障礙、血管炎、雙手X線平片、紅細胞沉降率（ESR）、C反應蛋白（CRP）、類風濕因子（RF）、抗環瓜氨酸肽（CCP）抗體等臨床指標數據。根據EULAR推薦的RA疾病活動指數（DAS）28評分將RA患者分為病情重度活動組（DAS28≥5.1）22例和病情中度活動組（3.2≤DAS28<5.1）14 例；根據雙手X線定義，≥3級為嚴重骨質破壞，≤2級為無或輕度骨質破壞，其中嚴重骨質破壞23例，無或輕度骨質破壞13例；心電圖異常包括竇性心動過速，竇性心動過緩，ST-T段壓低，T波異常，其中心電圖異常的16例，無異常20例；有類風濕結節、皮膚血管炎樣皮疹以及肌電圖提示有神經肌肉傳導異常則定義為有血管炎，其中有血管炎表現的6例，無血管炎表現的30例。健康對照組22例，來自門診體檢的健康自愿者，其中男性7例，女性15例，年齡26~70歲，平均（50±13）歲，2組在年齡及性別上差異無統計學意義（P>0.05）。本研究符合中國人體試驗委員會所制定的倫理學標準并得到了該委員會的批準，并取得了試驗對象的知情同意。

    1.2 試劑
    異硫氰酸熒光素（FITC）-抗人CD8抗體、藻紅蛋白（PE）-抗人IL-9、別藻藍蛋白（APC）-抗人CD3抗體、澡紅蛋白標記的鼠IgG2b同型對照購自美國eBio-science，佛波酯（PMA）、離子霉素、莫能菌數（Moen-sin）購自瑞士Alexis公司，RPMI 1640培養基購自Hyclone公司，固定劑、破膜劑購自美國Beakman-coulter公司，淋巴細胞分離液購自天津TBD公司，磷酸鹽緩沖液（PBS）購自歐蒙試劑公司。

    1.3 儀器
    HF90型二氧化碳孵育箱購自上海力申科學儀器有限公司，低速離心機系科大創新中佳公司，型號為KDL-40，流式細胞儀型號為FACScalibur,系美國BD公司產品。

    1.4 方法
    1.4.1 標本收集：早晨空腹留取各受試對象肝素鈉抗凝靜脈血4ml，離心留取1ml血漿，置于-80°冰箱中凍存。余下血細胞以密度梯度法用淋巴細胞分離液出外周血單個核細胞（PBMCs），用PBS洗滌細胞兩次。
    1.4.2 細胞染色及流式細胞儀發現：顯微鏡下觀察細胞形態及計數，并用1640培養基調整細胞濃度為5× /ml。依次加入佛波酯、離子霉素、莫能菌數，使其終濃度分別為50,1,0.5µg/ml，于 孵育箱中孵育6h后取出，以PBS洗滌2次。將上述培養好的標本分別進行熒光標記抗體的表面染色，每1× /ml細胞中分別加入抗IL-9澡紅蛋白10µl，4℃避光孵育25min，PBS洗滌后，1500r/min離心5min，棄上清，重復洗1遍，加入100µl 1%的多聚甲醛固定劑處理后上機檢測。我們定義CD CD IL- T細胞為外周血Th9細胞。
    1.4.3 胞外細胞因子檢測：IL-9的檢測方法嚴格按照酶聯免疫吸附試驗（ELISA）說明書操作。

    1.5 統計學處理
    采用SPSS17.0軟件包進行系統分析，對于正態分布及接近正態分布的劑量資料用 ±s表示，組間均數的比較采用t檢驗，相關性分析采用Spearman秩和相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

    2 結 果
    2.1 RA患者外周血中Th9及IL-9的比較：RA患者外周血中TH9表達率及IL-9水平明顯高于健康對照組，RA患者重度活動組的TH9比例及IL-9水平明顯高于中度活動組，RA患者組的Th9比例及IL-9水平均明顯高于健康對照組（P<0.05）。
    2.2 RA患者外周血中Th9與各臨床指標的相關性：Th9的表達水平與患者的關節壓痛數、關節腫脹數、ESR、CRP、DAS28及RF呈正相關，亦與血清中IL-9水平呈正相關（P均<0.05）；而與病程、晨僵、抗CCP抗體、心電圖異常、骨質破壞程度以及有無血管炎無相關性（<0.05）。
    2.3 RA患者血漿中的IL-9與各臨床指標的相關性：RA患者IL-9的水平與患者的關節壓痛數、關節腫脹數、ESR及DAS28呈正相關（P <0.05）；而與病程、晨僵、CRP、抗CCP抗體、RF、心電圖異常、骨質破壞程度以及有無血管炎無相關性（<0.05）。

    3 討論
    過去一直認為IL-9屬于Th2類細胞因子，可作用于多種炎癥細胞和組織細胞中，在對抗寄生蟲感染和誘導過敏性疾病，尤其是在過敏性哮喘中發揮著重要的作用。2008年Veldhoen和Dardalhon幾乎同時發現轉化生長因子（TGF）- 聯合IL-4刺激CD 初始T細胞可誘導出一類新型效應性獨立的T細胞亞群，可特異性分泌大量IL-9，命名為“Th9”細胞，系CD T細胞家族一新成員，并通過體外實驗證明TGF- 能夠誘導已經分化為Th2的細胞重新分化為Th9。進一步功能研究發現，Th9細胞在共刺激分子的作用下具有比初始T細胞更強的增值能力，但是并不具備免疫抑制功能，體內功能實驗提示了該細胞亞群與自身免疫病關系密切，主要作用是使炎癥細胞的數量上升并分泌一些炎癥介質，促進炎癥的發生，最新研究認為其特異的轉錄因子是PU-1。密切Th9與自身免疫病的確切發病機制還尚不清楚，本研究通過檢測RA患者外周血中Th9細胞及相關細胞因子IL-9的變化特點，分析該細胞與臨床指標及疾病活動的關聯性，并探討了該細胞在RA疾病發展中可能的作用。

    本研究發現，RA患者外周血Th9表達較健康對組組明顯增多，并且隨著病情活動度的增強，Th9的表達率越高，故推測Th9亦可促進RA患者體內炎癥的發生，該細胞的增多可能是RA反的重要原因。本研究同時顯示與Th9關系最密切的細胞因子IL-9的水平均隨著疾病活動度的增強而升高，同時RA患者血清中的該細胞因子水平均明顯高于健康對照組。Xing等研究過敏性哮喘患者體內的Th9表達率及IL-9水平時發現患者體內的含量明顯高于健康對照組，提出該細胞可以作用于炎癥細胞和組織細胞，使淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞的量增多，提高了IgE分泌，促進了炎癥細胞分泌一些細胞因子參與炎癥，并推測該細胞在過敏性哮喘等各種自身免疫病發生、發展的過程中起著主要的作用，這一觀點與Li等的看法一致。Zhou等研究多發性硬化的動物模型，發現其體內的Th9及IL-9含量亦顯著升高，并且用IL-9體內刺激星形膠質細胞可以引起Th17在局部的積聚，證實Th9細胞不但不會抑制效應性T細胞的增值，而且還有促進炎癥發生的作用，但是與多發性硬化發病的免疫學機制尚不清楚。目前國內外關于該細胞研究的熱點是在變態反應性疾病、腫瘤以及多多發性硬化等免疫性疾病方面，而以RA的臨床相關性研究尚未見報道。

    本研究亦發現Th9的表達水平與患者的DAS28評分、關節腫脹數、關節壓痛數、ERS、CRP等炎癥指標，及RF這一非特異性的抗體呈正相關，說明Th9細胞的過渡表達可能導致病情活動，進一步證實了Th9可以促進體內炎癥發生這一功能。而Th9表達率與病程無明顯相關性，說明Th9參與RA整個病程，貫穿疾病始終。從上述資料可以看出IL-9與DAS28評分、關節腫脹數、關節壓痛數、ESR等呈正相關，從而更加證明了Th9大量分泌IL-9，促進體內炎癥的發生，以至于誘發自身免疫病的發生。Jutel和Akdis發現在自身免疫病中Th9可誘發組織炎癥恰好可以解釋本研究中Th9及IL-9均與關節壓痛數、關節腫脹數呈正相關。文獻[3-4]發現IL-9的表達與促炎癥因子腫瘤壞死因子（TNF）- 、IL-1、IL-17、干擾素- 有一定的關聯，這些細胞因子與IL-9共同介導炎癥反應參與某些自身免疫病的病理過程。在RA患者中，血清IL-9伴隨著細胞因子TNF- 、IL-1、IL-17、干擾素- 的產生其水平亦上升，表明IL-9與這些促炎癥細胞因子共同參與了RA的病理過程，推測IL-9是調節自身免疫病的炎癥的一種治療靶向。Ciprandi等發現哮喘患者體內IL-9的水平與其癥狀嚴重程度相關，故推測IL-9的水平可作為自身免疫病活動的標志，與本研究得出的結果一致。目前國內外尚無關于該細胞與自身免疫病如RA病情活動度相關性研究。

    綜上所述，RA患者外周血中Th9表達率高于健康對照組，而RA中該細胞的表達率與病情活動度呈正相關，同時高Th9的表達率可表現出更多的關節腫脹、關節壓痛、關節畸形等臨床表現，更加提示了該群細胞的過渡表達也可能參與了RA的起病。而Th9緊密相關的細胞因子IL-9其水平與疾病活動度一致，并與疾病相關炎癥的指標呈正相關，說明該細胞參與了RA發病機制及疾病活動。

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