腫瘤壞死因子對類風濕關節炎的療效

    類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性對稱性多關節炎為主要臨床表現的自身免疫病。其發病機制還不清楚。研究發現，具有自身反應性的T細胞，如Th1細胞進而Th17細胞發揮了重要的作用，他們聚集到異常增生的滑膜組組，導致長期的關節炎癥和組織破壞。相比之下，具有可以抑制自身反應性淋巴細胞過度增值功能的調節性T細胞在RA患者中存在缺陷，進一步導致了機體免疫平衡的失調。近年來，生物制劑腫瘤壞死因子（TNF）- 拮抗劑成為治療RA療效確切的藥物之一，但其緩解病情的內在機制尚未完全明確。本研究旨在通過探討重組抗（TNF）- 人鼠簽合單克隆抗體（anti-TNF rcMAb）對RA患者外周血Th1、Th17、調節性T細胞比例以及他們相關的轉錄因子T-bet、維甲酸相關孤核受體（ROR）C、叉頭狀轉錄因子3（Foxp3）的影響，以期發現TNF- 拮抗劑治療方案的作用機制。

    1 對象與方法
    1.1 研究對象
    所有參與研究的患者均使用由中信國健藥業有限公司研制anti-TNF rcMAb。而次研究是由中信國健藥業有限公司2008年發起的以單用甲氨蝶呤為對照，平價注射用anti-TNF rcMAb聯合甲氨蝶呤RA的有效性和安全性的隨機、雙盲、多中心臨床試驗的一部分。本中心患者，共50例，男性7例，女性43例，年齡19~63歲，平均（46±12）歲。

    1.2 入選標準
    所有病例均符合美國風濕病學會1987年制定的RA分類標準，且篩選時病情處于活動期；使用甲氨蝶呤治療至少3個月，且劑量穩定在7.5~15mg/周，至少已4周；如正使用非甾體抗炎藥（NSAIDs），則劑量至少穩定一周；若篩選時未使用NSAIDs，則至少1周未用；若正口服糖皮質激素，則劑量必須穩定在≤10mg/d（相當于波尼松劑量）至少4周；曾使用過1種或1種以上改善病情抗風濕藥（DMARDs）治療失敗，但篩選前4周內已經停用甲氨蝶呤以外的DMARDs（包括但不限于：氯喹、羥氯喹、金制劑、青霉胺、柳氮黃吡啶、硫唑嘌呤、環磷酰胺、環孢素A、來氟米特、金諾分、雷公藤多苷等）。年齡18~65歲男女不限。

    1.3 排除標準
    過敏體質或已知對人免疫球蛋白過敏或對anti-TNF rcMAb成分過敏；關節功能狀態處于Ⅳ級或關節X征象處于Ⅳ級；篩選前4周內接種過活（減毒）病毒/細菌疫苗，或使用過治療RA的中草藥；篩選時正在參加其他臨床試驗；篩選前3個月內使用過任何生物制劑（如：依那西普、英夫利西單抗、阿達木單抗、利妥昔單抗等）；現患或曾有過活動性結核病史；篩選前6個月內曾有過嚴重的感染或正處于急性感染或慢性感染反復發作期；篩選前6個月內曾有過機會性感染；有人工關節感染史，或有可疑人工關節感染已經接受過抗生素治療且該人工關節未切除；篩選前3個月內進行過器官移植手術；現患者曾有過全身性自身免疫病，其癥狀和體征預期會影響對試驗藥物的評價。

    按照程序在研究開始前，由上海市光華中西醫結合醫院醫學理論委員會討論認為本研究符合人體試驗所制定的倫理學標準并得到院理論委員會批準。所有受試對象在篩選前均簽署知情同意書。

    1.4 分組情況
    所有患者均為風濕科門診患者，且均符合美國風濕病學會（ACR）1987年修訂的RA分類標準。由統計學專家使用SAS8.0軟件包隨機數字生成器生成隨機數字表并制定隨機卡片，按照隨機卡片由計算機產生序號、隨機數及分組數，制成隨機卡裝信封備用。合格受試者按進入臨床的先后順序，拆開號碼相同的信封，按信封內卡片規定的分組進行治療。由此隨機分為2組：①聯合治療組（甲氨蝶呤+anti-TNF rcMAb）：40例，其中男性3例，女性37例，年齡23~63歲，平均（46±11）歲；②對照組（甲氨蝶呤+安慰劑）10例，其中男性4例，女性6例，年齡19~59歲，平均（47±12）歲。

    1.5 給藥方法
    符合入組標準且不符合排除標準的RA患者由計算機程序按隨機分配原則分為2組。聯合治療患者接受anti-TNF rcMAb（3mg/kg）+甲氨蝶呤治療；對照組患者接受甲氨蝶呤單獨治療，分別于0、2、6、14周給藥。

    1.6 外周血Th1、Th17、調節性T細胞的檢測
    1.6.1 人外周血單個核細胞（PBMCs）的制備：肝素抗凝靜脈血與等體積RPMI 1640培養液充分混勻，用巴氏滴管將稀釋的血液輕輕加于淋巴細胞分離液Ficoll（勿擾亂液面），離心2000r/min，20min。離心后管內分為3層：上層為血漿和RPMI 1640培養液，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液，單個核細胞層分為白色絮狀，位于上、中層頁面交界處。小心吸出單個細胞層，至另一離心管中，加RPMI 1640培養液洗滌，離心1500r/min，10min，去上清，重復1次，重懸細胞，計數，待用。
    1.6.2流式細胞染色：對于胞內染色，PBMCs首選必須用聚丙烯酸甲酯（PMA）（50ng/ml）、羅紅霉素（500ng/ml）和高爾基體抑制劑（ColgiPlug）刺激5h。表面染色時，加入熒光標記的表面抗體人CD4-多甲澡葉綠素蛋白（Percp）-Cy5.5（BD Pharmingen），4℃，避光孵育30min。洗滌后，用破膜固定液固定，4℃，避光孵育20min，胞內染色時，用抗人白細胞介素（IL）-17-澡紅蛋白（eBioscience）和抗人IFN- -別澡青蛋白（APC，BD Pharmingen）染Th17和Th1細胞。

    進行調節性T細胞染色檢測時，表面染色用抗人CD4- Percp-Cy5.5（BD Pharmingen）和抗人CD25-澡紅蛋白（Miltenyi Biotec）染CD4和CD25分子，用Cytofix/Cytoperm緩沖液試劑盒（eBioscience）4℃、避光孵育30min，進行破膜固定，然后用抗人Foxp3-異硫氰酸熒光素（FITC）（eBioscience）4℃、避光孵育60min進行Foxp3染色。
所有染色樣本均由FACS Calibur流式細胞進行檢測，流式數據均用FlowJo軟件進行分析。

    1.6.3 實時定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測：RNA抽提：使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）抽提RNA，具體步驟：取（1~5）× 的細胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1次；加入含1% 2-ME的RIT裂解液350µl，反復吹打裂解；加入等體積70%乙醇混勻；吸出樣品上柱，室溫離心（12000r/min，15s）；棄收集管中液體，加RW1洗液350µl，室溫離心（12000r/min，15s）；棄收集管中液體，用RNeasy-free DNase試劑盒（Qiagen），加DNaseI（10µl+70µl緩沖液）76~80µl，室溫作用15min，去除DNA；加RW1洗液359µl，室溫離心（12000r/min，15s）；更換新的收集管，加RPE洗液（含乙醇）500µl，室溫離心（12000r/min，15s）；棄收集管中液體，室溫離心（12000r/min，2min）；棄收集管中液體，換RNeasy-free的1.5倍離心管作為收集管，加RNeasy free水30µl，離心（12000r/min，1min），收集RNA；吸光度 定量，計算RNA濃度，-80℃保存備用。

    cDNA合成：使用Sensiscript反轉錄試劑盒（Qiagen）進行逆轉錄，合成cDNA，反應體系為總體積：20µl/管（10×buffer 2µl，Dntp Mix（5mmol/L）2µl，隨機引物（50ng/µl）1µl，Sensiscriptnt逆轉錄酶1µl，RNA酶抑制劑（10U/µl）1µl，RNA<50ng，無RNA酶水補充至20µl。反應條件：37℃1h；93℃5min；4℃維持。完成逆轉后，-20保存備用。
   

    引物設計：應用PrimerEspress軟件（Applied Biosystems）進行引物設計，并用基本區域比對搜索工具（BLAST）進行比對確認。所引用的引物序列如下：甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）：上游引物5′-GT-GAAGGTCGGAGTCAACG-3′，下游引物 5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTC-3′；RORC：上游引物5′-CGGGCCTACAATGCTGACA-3′，下游引物5′-GCC-ACCGT-ATTTGCCTTCAA-3′;T-bet：上游引物5′-GCCTACCAGAATG-CCGAGATTA-3′，下游引物5′-TCAAAGTTCTCCCGGAATCCT-3′;Foxp3:上游引物5′-CGGACCATCTTCTGGATG-AG-3′,下游引物5′-TTGTCGGATG-ATGCCACAG-3′。
實時定量PCR檢測：將反轉錄產物cDNA，加雙蒸水4倍稀釋，用熒光染料SYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）5µl，與目的基因引物或內參引物0.15µl混勻，短暫離心。反應體系：總體積：10µl/孔（2×SYBR Green Master Mix 5µl，引物（5µmol/L）0.15µl，cDNA（去離子水5倍稀釋）4.85µl），加樣，三復孔，加密封膜。實時定量PCR儀檢測，程序如下：50℃，2min；95℃，10min；95℃，15s；60℃，60s；后兩步驟，作40個循環。根據PCR反應信號強度的Ct（threshold cycle）值，計算出樣本基因的相對表達量。

    1.7 療效觀察指標及評價指標 
    1.7.1 臨床指標：晨僵持續時間；關節腫脹計數；關節觸痛計數；疼痛程度；健康評估問卷（HAQ）;患者對自我疾病總體狀況的評估；醫生對患者疾病總體狀況的評估。 
    1.7.2 理化指標：紅細胞沉降率（ESR）；C反應蛋白（CRP）；類風濕因子（RF）；抗核抗體；Th1、Th17、調節性T細胞；雙手（含腕關節X線）。 
    1.7.3 評價指標：采用美國風濕病學會所指定的標準ACR20、ACR50、ACR70來評價療效。 

    1.8 統計學處理 
    采用SPSS11.0統計軟件進行分析。計量資料用t檢驗，計數資料用 檢驗或Ridit分析，以P<0.05為差異有統計學意義。 

    2 結果 
    2.1 患者基本情況和基本特征：患者的人口學特征和疾病情況。所有入選患者病程均屬于活動期中重度，70%以上患者RF呈陽性，平均病程4~6年。聯合治療組和對組組臨床及實驗室各項指標的基線差異無統計學意義，這些指標進一步說明患者具有中度或重度RA癥狀。2組治療前一般情況及各療效指標差異無統計學意義，具有較好的可比性。在14周的療程中，聯合治療組的脫落率為7.5%，對照組的脫落率為10%。2組脫落的主要原因是過敏反應、肝功能損害、血小板低于等不良反應。 
    2.2 2組有效率比較：經過Ridit分析，2組的ACR療效比較在治療后2周差異有統計學意義（P<0.01）。 
    2.3 2組聯合治療前后對Th1、Th17和調節性T細胞的影響：Th17細胞在對照組中有所上升，在聯合治療組中無明顯變化；在聯合治療組中，調節性T細胞比例明顯升高，差異且有統計學意義。 
    2.4 2組聯合治療前后對Th細胞轉錄因子的影響：治療前，聯合治療組和對照組差異無統計學意義，說明兩組具有可比性；無論是在聯合治療組還是對照組，Th17細胞與Th1細胞的轉錄因子Foxp3的表達量均升高，但差異無統計學意義。 

    3 討論 
    RA是一種以對稱性多關節炎為主要臨床表現的慢性、進行性、侵蝕性自身免疫病。其核心是滑膜和骨的侵蝕和破壞。RA的發病機制目前尚不十分清楚。最近認為，TNF- 和白細胞介素（IL）-1在其發病中起著關鍵的作用，并最終導致滑膜和關節軟骨的損傷，阻斷這些細胞因子的通路，可減輕炎癥及關節破壞，有效緩解RA病情。 

    致病性炎癥細胞Th17、Th1細胞及調節性T細胞亞群的失衡是引起RA發病及滑膜炎癥、骨破壞的機制之一。Th17細胞于2005年被定義為新的Th細胞亞群，分泌促炎性細胞因子IL-17、IL-17F、IL-21、IL-22，亦可分泌TNF- 和IL-6等，在自身免疫病和抗染色免疫中扮演了重要角色。Sakaguchi等在胸腺中分離得到一群高表達CD25的CD4單陽性T細胞，將其稱為調節性T細胞，在健康人和小鼠外周血和脾臟CD T細胞中占5%~10%。Foxp3是調節性T細胞特異性轉錄因子可抑制自身反應性淋巴細胞的過度增殖，在維持機體的免疫平衡、促進免疫耐受、預防和控制自身免疫疾病中起著重要的作用。RORC是促進Th17細胞分化、調節其功能的特異性轉錄因子。有關Th17和調節性T細胞亞群的研究揭示了RA發病機制的熱點之一。 

    經過我們18周隨機雙盲對照研究發現，聯合治療比單用甲氨蝶呤治療療程癥狀改善更為明顯，6周的ACR20有效率已經超過50%，ACR50、ACR70的有效率明顯高于對照組，甲氨蝶呤+anti-TNF rcMAb聯合用藥起效快，作用強度優于單用甲氨蝶呤的對照組。 

    同時，通過對患者治療前后的外周血輔助性T細胞亞群變化檢測發現：聯合治療組Th1細胞比例在第18周時有所下降，調節性T細胞比例明顯上升，Th17細胞比例幾乎無變化；在對照組中，Th1和調節性T細胞也相應降低和升高，但Th17細胞較第0周略有上升。實時定量PCR檢測各亞群細胞轉錄因子，Th17、Th1細胞的轉錄因子RPRC、T-bet表達在2組中均降低，調節性T細胞轉錄因子Foxp3表達均升高。 

    anti-TNF rcMAb與可溶性的TNF- 有很高的親和力，能有效地減輕患者的癥狀和降低疾病的活動度，如關節腫脹、疼痛、晨僵的改善及ESR，C反應蛋白的下降。在其他自身免疫病，如強直性脊柱炎、克羅恩病、銀屑病等的治療中療效也很好。研究發現，TNF可下調Foxp3的表達，從而抑制調節性T細胞的功能，本研究中證實，經過TNF- 抗體治療后的患者，臨床癥狀得到明顯改善，患者外周血調節性T細胞的比例明顯上升，Th1細胞的比例有所下降，其作用機制可能通過提高調節性T細胞的比例，進一步抑制Th1等炎癥細胞。 

    綜上所述，anti-TNF rcMAb聯合甲氨蝶呤用藥，可影響患者外周血Th17、Th1、調節性T細胞亞群的比例，對RA患者病情的改善起到一定的作用，這與陳俊偉等報道結果類似。通過本研究對RA免疫應答失衡機制有了更為深刻的了解。我們將進一步研究其對各群細胞功能的影響，以期進一步揭示anti-TNF rcMAb對控制RA病情的內在機制。

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