調節免疫細胞治類風濕關節炎的療效

    類風濕關節炎（rhrumatoid arthritis，RA）是一種以慢性、對稱性、多關節滑膜炎為特征的自身免疫病，由于抗原驅動和T細胞介導，進而活化其他免疫細胞及滑膜成纖維細胞，促使多種致炎性細胞因子產生增多，引起滑膜炎、血管翳并破壞骨及軟骨，導致關節畸形。因此，抑制T細胞的活化才能阻斷RA的免疫反應，有效控制病情及疾病發展。T細胞的共刺激分子是保證T細胞活化的關鍵，其中CD28和細胞毒T淋巴細胞相關抗原（CTLA）-4是通過這種正性和負性共刺激信號調節免疫應答的關鍵受體之一，通過與抗原遞呈細胞上的B7（CD80，CD86）結合，在介導免疫活性細胞間的信號傳遞、調節機體免疫功能方面起著重要的作用。CTLA-4與B7分子的親和力遠高于CD28和B7的親和力，對CD28介導的T細胞活化有較大的抑制作用。國內外研究發現CTLA-4的表達水平或功能的降低使自身免疫性T細胞克隆增值，并導致自身免疫的發生，在多種動物模型進行的臨床前研究表明，重組人CTLA-4抗體融合蛋白（rhCTLA-4Ig）可以有效治療一些自身免疫性疾病和抗排異作用。因此我們應用rhCTLA-4Ig治療RA患者，觀察其臨床療效，并且檢測其對血清腫瘤壞死因子（TNF）- 和趨化因子CX3CL1水平影響。 

    1 對象與方法 
    1.1 研究對象：44例中重度RA患者為我院風濕免疫科門診及住院患者，其中男性5例，女性39例，年齡26~64歲，平均（48±9）歲。納入標準：①符合1987年美國風濕病學會（ACR）RA分類標準，ACR功能狀態分類為Ⅱ~Ⅲ級；②用藥前疾病活動的判斷指標為：腫脹關節數（SJC）≥3個（計數66個關節），同時壓痛關節數（TJC）≥6個（計數68個關節），紅細胞沉降率（ESR）≥28mm/1h，或者C反應蛋白（CRP）≥12mg/L；③年齡18~65歲；④允許口服波尼松（≤10mg/d，或相當劑量的其他糖皮質激素）和非甾體抗炎藥（NSAIDs），但在基線期前其劑量穩定至少4周；⑤停用改善病情抗風濕藥(DMARDs)5個半衰期以上。排除標準：①合并其他免疫系統疾病，心血管、腎臟、肺部的疾病，腫瘤、感染等；②妊娠期、哺乳期或不同意在試驗期間采用有效避孕措施的婦女；③基線前4周內，關節腔內注射或其他途徑注射過皮質激素者。另以本院健康體檢者20名為健康對照組，其中男性7名，女性13名，年齡22~67歲，平均（45±10）歲。 

    1.2 分組治療：將44例RA患者按照隨機化產生的編號入組，分為rhCTLA-4Ig組和安慰劑組，每組22例。用藥期間，安慰劑與rhCTLA-4Ig采用相同的包裝，保持相同的劑型和外觀。rhCTLA-4Ig由上海中信國健提供的臨床Ⅱ期試驗藥品（批號為2006L01306），應用方法為入組后第0、15、29、57、85天靜脈給藥1次，劑量為10mg/kg，共5次，安慰劑為中信國健藥業提供的Ⅱ期臨床試驗安慰劑針。并且分別于第2、4、8、12周隨訪1次，第14周和第24走進行電話隨訪2次。該研究過程遵循我國人體試驗委員會制定的倫理學標準，并經我院理論委員會批準，所有患者遵循自愿原則參加中信國健的Ⅱ期臨床試驗并簽署知情同意書。 

    1.3 臨床指標的觀察及檢測：檢測RA患者活動度相關指標：ESR、CRP、類風濕因子（RF），統計RA患者腫脹關節數、壓痛關節數、晨僵時間。采用歐盟CAS評分觀察療效，同時應用ACR20、50、70標準進行療效評定，患者的功能狀況應用健康狀況問卷（HAQ）評估。同時檢測血常規、尿常規、肝功能、腎功能等臨床指標，并隨訪觀察藥物相關的不良反應。 

    1.4 血清TNF- 和CX3CL1水平的檢測：健康對照組及所有RA患者用藥及用藥12周后采靜脈血，3000r/min離心5min，分離血清，-80℃冰箱保存，同批檢測。一次凍融后進行TNF- 和CX3CL1水平的檢測，試劑盒和標準品由美國R﹠G公司提供，采用雙抗體夾心酶免疫吸附試驗（ELISA）法，具體步驟嚴格按說明書操作。 

    1.5 統計學處理：所有數據均使用SPSS11.5軟件系統處理，計量資料用 ±s表示，組間比較采用t檢驗，計數資料采用 檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。 

    2 結 果 
    2.1 RA患者rhCTKA-4Ig治療組及安慰劑組一般資料的比較：本中心臨床試驗共入組RA患者44例，rhCTKA-4Ig治療組及安慰劑組患者的一般資料基線情況差異無統計學意義（P>0.05）。 

    2.2 RA患者rhCTKA-4Ig治療組及安慰劑組用藥前后臨床相關的比較：rhCTKA-4Ig治療組及安慰劑組用藥前各項臨床相關指標組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。RA患者rhCTKA-4Ig治療組用藥12周后，腫脹關節數額、壓痛關節數、晨僵時間、HAQ評分、患者及醫生視覺模擬評分（VAS）均較治療前明顯下降，與治療前比較差異有統計學意義（P均<0.01），而且患者的ESA、CRP、DAS28評分等疾病活動指標與治療前相比也明顯下降，差異有統計學意義（P均<0.01），但是治療前后RF水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。同時安慰劑組經12周治療后上述各項觀察指標與用藥前比較差異均無統計學意義（P>0.05）。 

    2.3 rhCTKA-4Ig治療12周后RA患者ACR評分：rhCTKA-4Ig治療12周后95% RA患者（20/21）達到ACR20,76%RA患者（16/21）達到ACR50，19%RA患者（4/21）達到ACR70，而安慰劑組無一例達到ACR的緩解指標。2組ACR20、ACR50緩解率比較差異有統計學意義（ =39.17,26,69，P均<0.01），2組ACR70緩解率比較差異均無統計學意義（ =2.64,26,69，P>0.05）。 

    2.4 RA患者治療前后血清TNF- 、CX3CL1水平的比較：用藥前RA患者血清TNF- 、CX3CL1水平與健康對照組比較差異有統計學意義（P均<0.01），但是治療組與安慰劑組用藥前血清TNF- 、CX3CL1水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。經過12周治療后，rhCTKA-4Ig治療組TNF- 、CX3CL1水平明顯下降，與治療前比較差異有統計學意義（P均<0.01），而且與安慰劑組差異有統計學意義（P <0.05），.安慰劑血清TNF- 、CX3CL1水平用藥前后比較差異無統計學意義（P>0.05）。 

    2.5 安全性初步評價：rhCTKA-4Ig治療組22例患者中有1例在第一次靜脈滴注治療過程中出現蕁麻疹樣皮疹。推出臨床試驗，1例患者存在皮膚瘙癢，經對癥處理后緩解并完成實驗；其余20例患者在治療12周期間無不良反應發生，對本品耐受性好，無新發結核和惡性腫瘤，而且試驗過程呈監測血常規、尿常規及肝功能、腎功能等指標差異無統計學意義。另外我們隊患者用藥期間及用藥6個月后進行電話隨訪，無一例重癥感染發生。 

    3 討論 
    目前研究認為多種因數促使T細胞的活化的RA發病的始動環節，T細胞活化通過細胞-細胞間的黏附，致使多種免疫細胞活化，TNF- 、白細胞介素（IL）-1等多種細胞因子分泌增多，導致關節滑膜炎癥、血管翳形成、軟骨及骨侵蝕的發生。T細胞的活化需要雙信號系統，而CD28和CDLA-4是通過這種活化性和抑制性共同活化信號調節T細胞免疫應答的關鍵受體，研究發現在未治療的RA患者外周血CTLA-4的表達很低，rhCTKA-4Ig是由人CTLA-4細胞外部分和人IgGFc段形成的融合蛋白，能競爭性地與抗原遞呈細胞表面CD80/CD86結合，防止這些分子與T細胞的表面的CD28結合，選擇性地調節該刺激通路，阻斷T細胞活化和依賴T細胞的B細胞功能。在動物實驗中發現，CTLA-4Ig可以使IL-2、IL-4和IL-10的分泌和合成減少，同時它對免疫的早期和晚期反應都有抑制。本研究上海中信國健提供的，rhCTKA-4Ig用于RA治療進行Ⅱ期臨床觀察，發現RA患者經過12周治療后，患者的腫脹關節數、壓痛關節數明顯減少，晨僵時間縮短，HAQ評分等臨床癥狀明顯改善，而且ESR、CRP等疾病活動性指標較治療前明顯下降。21例完成試驗的RA患者中20例達到ACR20,16例達到ACR50，與安慰劑組比較差異有統計學意義，說明rhCTKA-4Ig臨床療效確實，而且與文獻的觀察結果相近。RA患者臨床癥狀的改善與rhCTKA-4Ig抑制T細胞活化，阻斷T細胞與單核巨噬細胞的相互作用，使前列腺素、白三烯等致炎細胞因子的分泌減少有關吧，進而使患者關節腫脹及疼痛癥狀明顯緩解，活動能力得到提高。 

    國內外研究已經證實，TNF- 是T細胞活化后產生，參與RA的炎癥反應、關節滑膜及劃破壞的關鍵細胞因子。因此，阻斷T細胞活化的協調刺激通路，才能抑制T細胞活化，使TNF- 、IL-1等細胞因子分泌減少。我們應用rhCTKA-4Ig治療RA是為了使rhCTKA-4Ig與T細胞表面的B7競爭結合，抑制B7與CD28的結合，抑制T細胞的活化，使TNF- 、IL-1等細胞因子分泌減少。我們的研究證實了這一結果，治療前RA患者血清TNF- 明顯高于健康對照組，而治療后TNF- 水平較治療前明顯下降。此外，RA患者發病機制中T細胞活化后通過T-B細胞的相互作用導致B細胞的活化，導致RF分泌增多，RF滴度升高是RA預后不良因素之一，因此我們期望通過rhCTKA-4Ig治療使B細胞活化受抑制，RF滴度下降，但是我們的研究沒有得到預期結果，這說明B細胞活化導致RF增多不單單由T細胞活化所致，可能受多方面機制調控和影響，需要更多的研究區證實。 

    研究發現，不僅TNF- 、IL-1等T細胞相關活化因子分泌增多在RA發病機制中發揮著重要的作用,而且RA患者體內多種異常升高的趨化因子促使T細胞、中性粒細胞等炎癥細胞向關節腔趨化，有人是導致關節關節滑膜及骨破壞的主要原因之一，特別是近兩年研發現，趨化因子CX3CL1在RA患者體內明顯升高，并通過促進滑膜成纖維細胞增值、基質金屬蛋白酶的合成及增強破骨細胞活化導致RA關節軟骨及骨的侵蝕和破壞，而且CX3CL1還通過募集單核細胞、自然殺傷細胞與內皮細胞的黏附，并加速血小板的活化，參與RA血管炎的發生，在RA發生發展過程中起著重要的作用。本研究也發現RA患者體內存在異常升高的CX3CL1，RA患者經過rhCTKA-4Ig治療后血清CX3CL1血清水平明顯下降。說明rhCTKA-4Ig不僅能阻斷協調刺激通路抑制T細胞的活化，減少TNF- 、IL-1等細胞因子的產生，而且使趨化因子CX3CL1是生成減少，這可能與TNF- 和多種趨化因子的產生促進有關。因此，應用rhCTKA-4Ig治療RA，一方面抑制與T細胞活化相關的細胞因子產生，另一方面減少了以CX3CL1為代表的趨化因子的分泌，使滑膜成纖維樣細胞、破骨細胞、內皮細胞的活化明顯受抑制，使基質金屬蛋白酶釋放減少，減輕關節滑膜増生及骨質破壞，明顯控制RA病情。此外已經有研究認為rhCTKA-4Ig主要抑制已經活化的T細胞，對正常的T細胞無明顯的抑制作用，所有對RA患者的正常免疫功能無影響，不會明顯增加感染的機會。我們對患者用藥期間及用藥6個月后進行電話隨訪，無一例重癥感染發生，也證實了這一點。本研究只有一例患者因出現皮膚蕁麻皮疹推出臨床試驗，可能與rhCTKA-4Ig未異體蛋白導致過敏有關，其他不良反應少見，總體耐受性良好。 

    綜上所述，rhCTKA-4Ig抗體融合蛋白為RA的臨床治療提供了新的靶向，通過抑制T細胞的活化阻斷TNF- 和CX3CL1的表達，明顯改善關節功能及疾病預后。

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