異基因造血干細胞移植免疫治療進展

    １９６８年中國人民解放軍第七軍醫(yī)大學本科畢業(yè)，１９８２北京醫(yī)科大學研究生畢業(yè)。１９８４和１９８９年先后在澳大利亞新南威爾士州立大學圣．文森特醫(yī)院和法國巴黎居里大學圣．安托萬醫(yī)學院客座研修�，F(xiàn)任中華血液學會、中國實驗血液學會常務委員，全軍血液學專業(yè)委員會主任委員等。兼任《中華血液學雜志》、《解放軍醫(yī)學雜志》、《中國實驗血液學雜志》、《臨床血液學雜志》、等７本雜志的副主編或編委。在國內外權威性醫(yī)學刊物上發(fā)表論文２２０余篇，主編醫(yī)學專著４部。獲國家級、全軍及省級科學技術進步獎２０余項。亨受政府特殊津貼。

    異基因造血干細胞移植�煟龋樱茫裕牭哪康氖墙�立供者型的正常造血與免疫功能，以取代受者原有的異常的造血及免疫系統(tǒng)。其治療惡性腫瘤的主要機制系利用正常供者的免疫系統(tǒng)識別和攻擊突變的腫瘤細胞（移植物抗瘤效應，ＧＶＴ）從而達到治愈目的。由于供受者間的免疫差異，即使ＨＬＡ完全相合的移植，也難完全避免移植后的相互排斥，即發(fā)生移植物抗宿主�。ǎ牵郑龋模┗蛞浦才懦猓ǎ龋郑牵�。由此可見，成功的異基因造血干細胞移植的全過程，從供者干細胞的植入、充分發(fā)揮ＧＶＴ效應、防治ＧＶＨＤ和ＨＶＧ，到受者造血、免疫功能的重建、腫瘤的完全治愈并保持健康的生活質量，主要技術皆與免疫學密切相關。本文將就異基因造血干細胞移植免疫治療方面的進展作簡要介紹。

    １．Ｔ細胞與移植

    過去十年中，由于支持治療，特別是先期的預防性抗感染治療、生長因子的應用及外周血造血干細胞的采用已使ＨＳＣＴ的療效取得突破性進展，移植相關并發(fā)癥及病死率已大幅降低。防治ＧＶＨＤ的免疫抑制劑包括各類化療藥物、抗淋巴細胞球蛋白,抗ＴＮＦ、ＣＤ52、ＣＤ25單抗等。盡管如此，ＧＶＨＤ仍是ＨＳＣＴ最棘手的并發(fā)癥，激素是目前最有效的治療藥物。ＧＶＨＤ危及生命，但是采用各種免疫抑制防治的同時勢必導致感染等各類嚴重的并發(fā)癥及腫瘤的復發(fā)，因此目前的焦點問題是如何在防治ＧＶＨＤ的同時避免免疫抑制所造成的各種并發(fā)癥。２０多年前開始采用的去Ｔ細胞移植盡管使ＧＶＨＤ得到控制，但移植排斥、復發(fā)、因免疫重建延遲帶來的嚴重感染等問題隨之而來，更重要的是在ＨＳＣＴ治療中最為關鍵的ＧＶＴ效應大打折扣，去Ｔ細胞移植后的無病生存（ＤＦＳ）與非去Ｔ細胞移植相比并無顯著區(qū)別。臨床資料表明，ＧＶＨＤ與ＧＶＴ的關系錯綜復雜：ＧＶＨＤ的出現(xiàn)有助于降低腫瘤的復發(fā)率，但在無ＧＶＨＤ發(fā)生的情況下進行供者淋巴細胞輸注（ＤＬＩ）也可使白血病得到治愈，這一結果支持動物及體外實驗中的發(fā)現(xiàn)，即ＧＶＨＤ和ＧＶＴ效應兩者的確是可分離的。目前的問題是：在臨床移植中如何找到有效可行的辦法，從而在防止ＧＶＨＤ的同時發(fā)現(xiàn)ＧＶＨＤ和其他免疫反應的區(qū)別，以保留ＧＶＴ效應和機體針對感染的免疫應答。

    隨著對Ｔ細胞免疫反應和該過程中Ｔ細胞分化、成熟的深入了解，對異體移植物進行適當?shù)奶幚�、對其中不同的免疫反應細胞進行調控，已使加強ＧＶＴ及抗感染效應、減輕或避免ＧＶＨＤ的發(fā)生成為可能。

     １．１ 通過選擇性去Ｔ細胞分離ＧＶＨＤ和ＧＶＴ效應

    對異源反應性Ｔ細胞進行清除、轉移或誘導無反應性，如ＣＤ40配體的抗體可阻斷宿主抗原提呈細胞�煟粒校茫牭牡诙�信號，抗Ｔ細胞活化的抗體（ＣＤ69、ＣＤ25、Ｆａｓ）通過中和免疫毒素或誘導凋亡而殺傷Ｔ細胞，免疫磁珠或流式分選轉移已活化的Ｔ細胞等。新近采用的光動力學方法利用對光敏感的若丹明染料ＴＨ９０４２來清除Ｔ細胞，在可見光的作用下，藥物發(fā)出放射活性從而選擇性地殺傷活化的Ｔ細胞。

    Ｍｉｃｈａｌｅｘ等的實驗研究成功地找到了引起ＧＶＴ效應和ＧＶＨＤ反應的Ｔ細胞確實來源不同的分子學證據(jù)，他們以病人的白血病或淋巴細胞刺激供者Ｔ細胞并通過ＴＣＲ序列確認了白血病特異性克隆，ＧＶＴ效應可被腫瘤特異性抗原（不引起ＧＶＨＤ）介導。因此選擇性地去除非腫瘤細胞的抗原特異性Ｔ細胞，而不傷及腫瘤抗原特異性Ｔ細胞，便可達到分離ＧＶＨＤ和ＧＶＴ的目的。在移植模型中，現(xiàn)已能成功地去除宿主抗原在體外激活的Ｔ細胞而并不損傷抗白血病效應。采用前述光動力方法，發(fā)現(xiàn)當帶有染料的細胞被光照后，對宿主正常組織具有特異性的殺傷性Ｔ細胞顯著減少，但腫瘤特異性Ｔ細胞及除此兩者之外的第三類Ｔ細胞的大部分仍保留。選擇性地去除Ｔ細胞或誘導Ｔ細胞無反應的臨床試驗已在開展，在半相合移植治療兒童非腫瘤性疾病的臨床研究中，以蓖麻毒素－Ａ鏈免疫毒素選擇性地去除ＣＤ２５，初步的結果顯示ＧＶＨＤ的發(fā)生率明顯降低，并且雖然僅輸入了小劑量的Ｔ細胞，免疫重建也明顯優(yōu)于非選擇性去Ｔ細胞的移植。來自美國ＮＩＨ的非清髓性ＨＬＡ相合同胞移植研究，同樣應用上述免疫毒素選擇性去除１×１０８／ｋｇ的ＣＤ３＋細胞，供者的反應細胞被置于宿主髓系細胞或Ｂ細胞的環(huán)境中，以使對系性限制性白血病或非白血病抗原發(fā)生反應的Ｔ細胞得以保留，結果顯示供者細胞完全植入，ＧＶＨＤ減輕。

    １．２ 轉移童貞（ｎａ�啠觯澹�Ｔ細胞

    在小鼠試驗中，童貞Ｔ細胞從未接觸過抗原，表達ＣＤ62Ｌ，而接觸過抗原的記憶或活化Ｔ細胞可能是ＣＤ62Ｌ+或ＣＤ62Ｌ-細胞。假設供者Ｔ細胞從未接觸過宿主抗原，那么ＧＶＨＤ中被誘導的Ｔ細胞將是童貞Ｔ細胞，記憶／活化Ｔ細胞將不能誘導ＧＶＨＤ�；旌狭馨图毎�培養(yǎng)�煟停蹋遥狅@示異體細胞的增殖潛力在童貞細胞（ＣＤ62Ｌ+）群中更為突出，在移植模型中，分別將ＣＤ62Ｌ+和ＣＤ62Ｌ-輸入體內�熗�貞Ｔ表型的細胞可引起ＧＶＨＤ�煻�記憶Ｔ細胞無此效應。

    １．３ 篩選Ｔｈ２／Ｔｃ２細胞

    目前已確認的功能性Ｔ細胞有：ＣＤ4+輔助性Ｔ細胞（Ｔｈ１或Ｔｈ２亞群）、ＣＤ8+殺傷性Ｔ細胞（Ｔｃ１或Ｔｃ２亞群）。Ｔｈ１和Ｔｃ１分泌ＩＬ－２和ＩＦＮ－γ，Ｔｈ２和Ｔｃ２分泌ＩＬ－４、ＩＬ－５和ＩＬ－１０。在動物實驗中，供者Ｔｈ２細胞不啟動ＧＶＨＤ，但可介導ＧＶＴ效應，且Ｔｃ２細胞發(fā)揮了強力的否決（Ｖｅｔｏ）效應而避免移植排斥�熞虼撕Y選Ｔｈ２和Ｔｃ２細胞可促進植入，啟動ＧＶＴ效應而避免ＧＶＨＤ。上述動物實驗的成功，促進了在非清髓性移植中輸注Ｔｈ２／Ｔｃ２細胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的臨床試驗的開展。

    １．４應用輔助性Ｔ細胞

    輔助性Ｔ細胞為ＣＤ4、ＣＤ25陽性細胞，對誘導和維持自身耐受非常重要。動物實驗中去除這種細胞會導致自身免疫或加劇ＧＶＨＤ；輸注這類細胞，在自身免疫模型中可消除自身免疫，在移植模型中則可抑制ＧＶＨＤ。這一結果提示ＣＤ4+、ＣＤ25+輔助性Ｔ細胞具有強大的免疫調節(jié)作用，但同時動物實驗中也顯示去除這些細胞會促進腫瘤特異性免疫應答從而清除腫瘤，因此該類細胞的應用是否會消弱ＧＶＴ尚需進一步的臨床研究來證實。

    ２．ＮＫ細胞與移植

    Ｔ細胞異基因免疫應答需要激活和擴增，ＮＫ細胞則通過與其他細胞間的相互作用產生一個陽性信號，而后通過釋放穿孔素、顆粒酶直接殺傷靶細胞。研究發(fā)現(xiàn)Ｔ細胞是ＧＶＨＤ的主要效應細胞，而ＮＫ細胞則是ＧＶＴ及ＨＬＡ不相合移植成功植入的主要效應細胞。

    ２．１ ＮＫ細胞的活化與抑制

    ＮＫ細胞表達ＣＤ25、ＣＤ16，不表達ＣＤ3，通過細胞毒性作用和分泌細胞因子如ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及ＧＭ－ＣＳＦ等發(fā)揮效應。ＮＫ細胞對于移植的重要性源于其對ＭＨＣ－Ｉ類抗原的識別。人類ＮＫ細胞至少表達四種活化型受體及兩種抑制性受體。ＮＫ細胞對ＭＨＣ－Ｉ類分子的特異性識別是通過含有免疫受體酪氨酸活化性基序（ＩＴＡＭ）的殺傷細胞免疫球蛋白超家族受體（ＫＩＲ）和ＣＤ９４家族的Ｃ型凝集素受體來實現(xiàn)。ＮＫＧ２Ｄ是ＮＫ細胞活化型受體，可識別ＭＨＣ－Ｉ類分子，其他活化型受體可識別一些尚未明確的配體。含有免疫受體酪氨酸抑制性基序（ＩＴＩＭ）的ＫＩＲ和ＣＤ94家族的其他Ｃ型凝集素可抑制ＮＫ細胞的活化。編碼活化及抑制型ＫＩＲ的基因位于１９號染色體，Ｃ型凝集素受體基因位于１２號染色體。細胞表面受體介導活化和抑制信號的平衡從而調整ＮＫ細胞的功能，如圖所示為ＮＫ細胞的活化與抑制模式�熣�常細胞表達的ＭＨＣ－Ｉ類分子與ＮＫ細胞上的殺傷抑制型受體連接，活化信號被抑制使ＮＫ細胞不產生使靶細胞溶解的溶細胞活性。缺少ＭＨＣ－Ｉ類分子表達的異常細胞，活化信號因不能被殺傷抑制性受體傳遞的抑制信號阻斷，故被ＮＫ細胞溶解。

    正常情況下，ＮＫ細胞表面的ＫＩＲ識別靶細胞的ＭＨＣ－Ｉ類分子配體，如ＨＬＡ－Ｃ和ＨＬＡ－Ｂｗ４等。由于ＮＫ細胞至少表達自身ＭＨＣ－Ｉ類分子的一個抑制受體，ＫＩＲ與自身細胞的ＭＨＣ配體結合從而發(fā)出殺傷抑制信號，阻止ＮＫ細胞對正常組織的非特異性殺傷作用，從而對自身正常組織產生保護作用。當ＮＫ細胞不能識別自身ＭＨＣ－Ｉ類分子時，殺傷的抑制信號不能傳遞，ＮＫ細胞即釋放穿孔素／顆粒酶直接殺傷靶細胞，隨即產生一系列臨床免疫損傷。

    ２．２ ＮＫ細胞的異源反應活性

    多數(shù)人表達較完全的ＫＩＲ抑制性受體基因，可識別３組主要ＨＬＡ－Ｉ類配體（第１組ＨＬＡ－Ｃ，第２組ＨＬＡ－Ｃ，ＨＬＡ－Ｂｗ４）。對１６２例個體進行分析，９７％的ＫＩＲ表達ＫＩＲ２ＤＬ基因，是第１組ＨＬＡ－Ｃ抗原決定簇的受體；１００％ＫＩＲ表達ＫＩＲ２ＤＬ２／３，為第２組ＨＬＡ－Ｃ抗原決定簇的受體；９４％表達ＫＩＲ３ＤＬ１，是ＨＬＡ－Ｂｗ４抗原決定簇的受體。ＫＩＲ獨特型不相合移植中，當異體靶細胞不表達Ｉ類等位基因時便不能阻斷ＫＩＲ，ＮＫ細胞即可發(fā)揮其溶細胞活性。

    半相合移植中，由ＮＫ細胞介導的溶細胞活性由供者ＮＫ細胞的ＫＩＲ獨特型與受者ＨＬＡ－Ｉ類分子的不相合所觸發(fā)。這一作用目前被稱為供者抗受者的ＮＫ細胞異源反應活性。在動物模型中，ＮＫ細胞強有力地攻擊宿主的造血細胞，而對通常Ｔ細胞在ＧＶＨＤ中針對的靶組織則不具有殺傷作用。將人的異源反應活性ＮＫ細胞（ＫＩＲ獨特型不相合）輸入已植入人ＡＭＬ細胞的ＮＯＤ／ＳＣＩＤ小鼠�熢趯φ战M，小鼠３周后死亡，而在治療組，少量的人異源反應活性ＮＫ細胞即可清除白血病細胞，使小鼠得以存活。在子代Ｆ１ Ｈ２ｄ／ｂ小鼠（供鼠）與親代Ｈ－２ｂ小鼠（受鼠）的移植中，供者的ＮＫ細胞不表達Ｈ－２ｂ特異性的Ｌｙ４９Ｃ／Ｉ受體，而表達Ｈ－２ｄ特異性的Ｌｙ４９Ａ／Ｇ２受體，因此供者ＮＫ細胞可殺滅宿主的靶細胞。研究還發(fā)現(xiàn)，即使輸入大劑量的異源反應活性ＮＫ細胞給經過致死性放療處理過的受者也并不導致ＧＶＨＤ。在非致死性放療處理過的受者中，異源反應活性ＮＫ細胞可將骨髓和脾中的受者Ｔ細胞和中性粒細胞數(shù)降低至低于經致死性預處理的受者的水平。單獨接受非致死性ＴＢＩ（小于７Ｇｙ）預處理的小鼠對供者的骨髓移植物發(fā)生排斥，但同時接受異源反應活性ＮＫ細胞輸注的小鼠，其體內則持續(xù)出現(xiàn)了供者型造血細胞。２×１０５個供者異源反應活性ＮＫ細胞即可導致受者體內出現(xiàn)供者型造血，而非異源反應活性ＮＫ細胞則不具備該效應。異源反應活性ＮＫ細胞甚至可以在非清髓性ＨＳＣＴ中發(fā)揮作用，經過非清髓性預處理的小鼠同時接受低劑量的異源反應活性ＮＫ細胞輸注，可檢測到大于８０％的供者型嵌合；即使給予僅包括氟達拉賓的強度較低的預處理，也可達到３０％以上的供者型嵌合。在移植后６周輸入供者的異源反應活性ＮＫ細胞，可將混合型嵌合體轉變?yōu)椋保埃埃ス┱咝颓逗�。研究推測ＮＫ細胞使宿主免于ＧＶＨＤ損傷的保護機制在于異源反應活性ＮＫ細胞能攻擊受者的ＡＰＣ細胞，而后者為啟動ＧＶＨＤ所必需。

    ２．３ ＮＫ細胞在植入、ＧＶＨＤ及ＧＶＴ中的作用（見圖２）

    綜上所述，與Ｔ細胞的異源反應活性不同，ＮＫ細胞的異源反應活性因其下述特性非常適用于移植：①通過殺傷宿主的淋巴系造血細胞而促進植入。在ＨＬＡ不相合移植中，供者ＮＫ細胞可產生移植物異源反應活性，從而通過識別和殺傷受者殘留的淋巴系細胞有力地促進植入。②異源反應活性ＮＫ細胞可殺滅白血病細胞，從而發(fā)揮ＧＶＴ效應。ＮＫ細胞遇到ＫＩＲ獨特型不相合的腫瘤細胞時，即表現(xiàn)出強大的細胞毒作用，這是ＨＬＡ相合移植和自體移植不能比擬的。ＮＫ細胞不相合的優(yōu)勢已在ＡＭＬ患者半相合或無關供者去Ｔ移植后復發(fā)率顯著降低中得到證實，但迄今為止�熯@一優(yōu)勢僅局限于髓性白血病和去Ｔ細胞移植。③ ＮＫ細胞強力攻擊宿主的造血細胞，而對ＧＶＨＤ攻擊的靶組織則不具有殺傷作用，因此并不誘導ＧＶＨＤ，進一步能通過殺傷宿主ＤＣ�煒渫粻罴毎��牰�抑制Ｔ細胞介導的ＧＶＨＤ。

    ２．４ 異源反應性ＮＫ細胞在ＨＳＣＴ中的應用

    實驗證明，輸入具異源反應活性的ＮＫ細胞與ＡＭＬ移植后復發(fā)率降低直接相關。體外研究顯示，異源反應活性ＮＫ細胞具有顯著的ＧＶＴ效應，可１００％殺滅白血病細胞，但只有少部分表達淋系標記的急性淋巴細胞白血病的腫瘤細胞被溶解，這是迄今為止在原發(fā)腫瘤中對ＮＫ異源反應活性唯一不敏感的腫瘤細胞。

    動物實驗的成功已使一些研究小組選擇性地開展ＮＫ細胞不相合的無關供者移植或半相合移植，并由此設想輸注來自供受者之外的第三者的異源反應性ＮＫ細胞來增強ＧＶＴ效應、防止ＧＶＨＤ。Ｒｕｇｇｅｒｉ等在５７例高危ＡＭＬ移植中輸注異源反應活性ＮＫ細胞，結果白血病的復發(fā)率顯著降低，同時也避免了ＧＶＨＤ。Ｖｅｌａｒｄｉ等對１９９３～２００３年間的８５例晚期ＡＭＬ（ＣＲ２≥８０％）半相合移植進行了分析，結果顯示輸注供者不相合ＮＫ細胞促進了植入而未加�。牵郑龋模�更有意義的是白血病的復發(fā)得到了有效控制。在無ＮＫ細胞異源反應活性的４４例移植中（２１例為ＣＲ，２３例為復發(fā)病例），移植后的復發(fā)率為７９％，無事件生存率（ＥＦＳ）為７％；而在３６例（２３例為ＣＲ，１３例為復發(fā)病例）輸入ＮＫ異源反應活性細胞的移植中，移植后的復發(fā)率為１７％，ＥＦＳ為５２％，由此得出結論，無ＮＫ細胞異源反應活性的供者是預測移植復發(fā)的獨立因素。

    ＫＩＲ獨特型可由ＰＣＲ法確認，３％的人群不表達ＫＩＲ２ＤＬＩ，６％不表達ＫＩＲ３ＤＬ１，ＫＩＲ２ＤＬ２／３則１００％表達，識別ＫＩＲ基因型有助于最終確定具有異源反應活性ＮＫ細胞的供者。對此類供者的選擇已由目前從父母兄弟姐妹的直系親屬范圍擴展至姨表、叔表等親系中。第１組、第２組ＨＬＡ－Ｃ及ＨＬＡ－Ｂｗ４抗原決定簇均表達者，找不到ＮＫ細胞不相合的供者，而僅有三者之一或三者之二表達者則有機會找到。

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