精子DNA碎片化在男性不育中的研究進(jìn)展

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目前對精子DNA碎片的研究正處于初步探索的階段，且其具體發(fā)生機(jī)制尚未完全弄清。但現(xiàn)有的一系列研究結(jié)果顯示，其在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域中仍顯示出了巨大的預(yù)測價(jià)值。本文分析了精子DNA碎片發(fā)生機(jī)制、檢測技術(shù)有關(guān)問題的研究現(xiàn)狀，以及精子DNA碎片率增加對輔助生殖結(jié)局的影響。

1 精子DNA碎片種類和形式

從種類來源而講，精子DNA碎片包括核DNA碎片和線粒體DNA碎片。有相關(guān)研究表明不育男性的精子細(xì)胞核內(nèi)存在較高水平的DNA碎片率，且與臨床妊娠率、分娩率呈負(fù)相關(guān)，并且Venkatesh等研究顯示，不育男性患者精子細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在高發(fā)的線粒體DNA損傷；而從DNA碎片形式來講，精子DNA碎片包括DNA單鏈碎片和DNA雙鏈碎片。迄今為止，研究人員已經(jīng)認(rèn)識(shí)到的DNA鏈損傷形式包括，全基質(zhì)模式、堿基缺失(形成無堿基位點(diǎn))、堿基修飾(堿基氧化、烷基化等)、DNA交聯(lián)等。一般情況下，DNA單鏈碎片較雙鏈碎片更為常見，且在一定條件下，如果單鏈DNA碎片不能及時(shí)被修復(fù)，某些DNA單鏈碎片會(huì)進(jìn)一步破壞形成DNA雙鏈碎片，進(jìn)而會(huì)造成DNA斷鏈之間和DNA一蛋白質(zhì)的相互纏繞而形成較大的“DNA 碎片”，這既反映出了DNA碎片的產(chǎn)生是一個(gè)動(dòng)態(tài)、循序漸進(jìn)的過程，也標(biāo)志著精子DNA損傷的嚴(yán)重程度存在著差異性，其對男性生育能力造成的影響也有所不同。

2 精子DNA碎片化的發(fā)生機(jī)制

2.1 精子細(xì)胞核結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

作為男性的配子生殖細(xì)胞，精子是一種單倍體，故其DNA含量僅是體細(xì)胞的一半。在正常狀態(tài)下，精子細(xì)胞除了合成少量功能蛋白外，基本上處于休止?fàn)顟B(tài)。與體細(xì)胞的核蛋白(主要是組蛋白)不同，精子的核蛋白主要為魚精蛋白，后者是一種富含精氨酸和半胱氨酸的堿性蛋白。由于精子核DNA帶有負(fù)電荷，能夠與帶正電荷的精氨酸基團(tuán)之間形成特殊的氫鍵；另外，半胱氨酸之間可形成分子間二硫鍵而有利于染色質(zhì)絲的排列穩(wěn)定。由于以上原因，使得精子核染色質(zhì)的密度要明顯高于體細(xì)胞，精子頭部體積“適當(dāng)縮小”，生化性質(zhì)也比較穩(wěn)定，以致能夠滿足精子穿透卵細(xì)胞的能力。然而，也正是以上因素，導(dǎo)致精子細(xì)胞核DNA 自身修復(fù)能力以及應(yīng)對內(nèi)外界環(huán)境有害刺激的能力大大降低。另一方面，從生精細(xì)胞分化、產(chǎn)生出功能正常的精子是一個(gè)很漫長的過程，且受到多種因素的協(xié)調(diào)控制，如果機(jī)體暴露于某些有害因素環(huán)境中，也就更容易造成精子發(fā)生過程中的遺傳物質(zhì)損傷和結(jié)構(gòu)功能異常。

2.2 精子DNA碎片化的發(fā)生機(jī)制

精子DNA碎片化發(fā)生的機(jī)制尚不完全清楚，但目前研究表明，主要與精子發(fā)生過程中遭受有害刺激因素后而弓l發(fā)的氧化應(yīng)激有關(guān)，另外，還與精子發(fā)生過程中異常的染色體組裝、精子的異常凋亡有關(guān)。

2.2.1 氧化應(yīng)激：氧化應(yīng)激(OS)是指發(fā)生在需氧機(jī)體內(nèi)的一種病理性效應(yīng)。正常情況下，氧氣通過參與機(jī)體細(xì)胞內(nèi)一系列“生物轉(zhuǎn)化作用”而形成各種各樣的氧化產(chǎn)物(某些具有較強(qiáng)的氧化性)，同時(shí)，機(jī)體細(xì)胞內(nèi)存在具有一定抗氧化能力物質(zhì)組成的抗氧化系統(tǒng)，在大多數(shù)生理環(huán)境條件下，機(jī)體內(nèi)的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間能夠保持相對平衡狀態(tài)。這種平衡不僅是機(jī)體內(nèi)環(huán)境處于“穩(wěn)態(tài)”的前提，而且是機(jī)體細(xì)胞能夠完成特殊生理、生化反應(yīng)過程的一個(gè)重要保障。所以說，一切需氧細(xì)胞的生理過程中必然涉及到活性氧類物質(zhì)(ROS)的產(chǎn)生和清除，但在某些情況下，生物機(jī)體受到環(huán)境有害刺激因素或其他條件的限制時(shí)，就會(huì)引起高活性氧化物質(zhì)系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡遭到破壞，機(jī)體也就進(jìn)入氧化脅迫狀態(tài)(又稱氧化應(yīng)激)，過量的活性氧類物質(zhì)可造成細(xì)胞膜中多聚不飽和脂肪酸的氧化、細(xì)胞器生化反應(yīng)涉及的關(guān)鍵酶受抑制和破壞、甚至細(xì)胞核DNA鏈的斷裂破壞等，從而導(dǎo)致機(jī)體的組織損傷和功能失調(diào)，甚至將存在缺陷的遺傳物質(zhì)傳遞給后代而導(dǎo)致不良的妊娠結(jié)局。

研究報(bào)告表明，氧化應(yīng)激與人體許多疾病狀態(tài)有關(guān)，包括衰老、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥、肝臟疾病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、艾滋病、毒素、農(nóng)藥化學(xué)制品暴露以及男性不育等。據(jù)此可知，一部分男性不育癥可能是伴隨著身體其他疾病而出現(xiàn)的。由于機(jī)體內(nèi)不同組織和細(xì)胞的組成成分、結(jié)構(gòu)特性等存在較大差異，因此它們對氧化應(yīng)激的敏感性和反應(yīng)性也就各不相同。1979年Jones等首先提出，人類精子對氧化應(yīng)激特別敏感，并推測其可能與男性不育相關(guān)，即精子暴露于過量的活性氧分子環(huán)境中，可造成其細(xì)胞質(zhì)膜中多聚不飽和脂肪酸的過氧化，引起多聚脂肪酸中雙鍵的破壞，而這些雙鍵對于維持精子膜的流動(dòng)性又是必不可少的，因此，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致精子細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，并且還能夠引起兩種嚴(yán)重的“連鎖反應(yīng)”：一方面，氧化應(yīng)激引起精子細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，精子細(xì)胞的代謝功能受到抑制、甚至喪失，就可促進(jìn)精子細(xì)胞的凋亡過程，引起精子細(xì)胞核碎裂，核DNA碎片增多等；另一方面，精子細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)破壞，就會(huì)導(dǎo)致精子核DNA直接暴露于精漿中活性氧類物質(zhì)中(主要是精漿中白細(xì)胞產(chǎn)生ROS)，這時(shí)就會(huì)導(dǎo)致精子DNA遭受ROS的正面攻擊而引起大范圍的DNA單鏈、雙鏈的斷裂、破壞，引起精子遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)受損、功能缺陷而導(dǎo)致男性不育。在隨后的實(shí)驗(yàn)研究中，將精子暴露于人工產(chǎn)生的ROS環(huán)境中培養(yǎng)一段時(shí)間后，可導(dǎo)致精子DNA多種形式的損傷破壞：包括堿基修飾、移碼、缺失、產(chǎn)生無堿基位點(diǎn)、DNA鏈斷裂、交聯(lián)以及染色體的重排等。Smith等研究顯示，與正常生育力男性相比較，精索靜脈曲張不育患者的精子DNA碎片指數(shù)要明顯高于前者，而且DNA碎片率指數(shù)與精液中ROS水平呈正相關(guān)。并且，在對上述患者施以精索靜脈曲張結(jié)扎術(shù)后，精子DNA碎片率指數(shù)顯著下降。由此研究人員推斷，精子DNA損傷以及碎片的產(chǎn)生可能與精液中較高水平的ROS相關(guān)。但就其具體的發(fā)生機(jī)制，仍尚未完全弄清。

2.2.2 精子發(fā)生過程中的染色質(zhì)組裝異常：精子作為男性的配子生殖細(xì)胞，其染色體和DNA數(shù)量僅為體細(xì)胞的一半，而這是精原細(xì)胞進(jìn)行染色質(zhì)組裝、平均分配到2個(gè)精子細(xì)胞的結(jié)果。然而，精子核染色質(zhì)的組裝過程容易受到機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的有害因素干擾而出現(xiàn)異常，進(jìn)而導(dǎo)致精子遺傳物質(zhì)方面的缺陷。正如早期研究所指出，隨著精子發(fā)生進(jìn)程的開始，精子細(xì)胞核DNA就會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和生化功能方面的變化，尤其在精子發(fā)生周期中期時(shí)，伴隨著核組蛋白被魚精蛋白替代之后，精子核凝集程度大大增加，進(jìn)而形成精子DNA超螺旋結(jié)構(gòu)，然而在DNA超螺旋無限制的折疊壓縮過程中，就不可避免地引起DNA雙鏈之間存在扭曲應(yīng)力。正因如此，為了能夠減少精子DNA雙鏈間扭曲應(yīng)力的不利影響，以便促進(jìn)魚精蛋白與DNA鏈的黏合附著，DNA鏈需要在其特定位點(diǎn)進(jìn)行“解鏈”以及后來的酶修復(fù)連接使之恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。但這一過程十分精細(xì)復(fù)雜，易被來自內(nèi)外環(huán)境的各種有害因素所干擾，甚至引起精子DNA單鏈不能正常修復(fù)(超過其修復(fù)能力)，進(jìn)而導(dǎo)致精子DNA雙鏈碎片的產(chǎn)生和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞，而且，這一現(xiàn)象已在動(dòng)物研究中證實(shí)。從這里可以看出，雖然精子為使其保持較強(qiáng)穿透卵子透明帶的能力，染色質(zhì)最終能夠達(dá)到一個(gè)高度濃縮、凝集的特殊結(jié)構(gòu)形式而有利于執(zhí)行其功能，但從另一方面，同時(shí)降低了其本身應(yīng)對內(nèi)外環(huán)境損傷的修復(fù)能力。

2.2.3 精子異常凋亡：細(xì)胞凋亡，又稱為程序性細(xì)胞死亡，是真核生物有核細(xì)胞的一種主動(dòng)性生理性過程，它是細(xì)胞在一定的生理、病理?xiàng)l件下而發(fā)生的以細(xì)胞核碎裂為主要表現(xiàn)的細(xì)胞死亡。早期研究人員即已發(fā)現(xiàn)，凋亡的細(xì)胞核內(nèi)的DNA能被內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶分解為一些分子量較小的雙股寡核苷酸片段。而后來，研究人員在其建立的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校�人工敲除小鼠的端粒酶催化亞基基因以誘導(dǎo)其進(jìn)入細(xì)胞凋亡應(yīng)激狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)其精子DNA碎片率程度是其實(shí)驗(yàn)前的7倍。因此，研究人員推測，小鼠精子DNA碎片率顯著增加可能與其凋亡應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。

另外，氧化應(yīng)激與人體的許多疾病狀態(tài)有關(guān)，而且能夠引起精子DNA的損傷、破壞、碎片率增高等。長期暴露于污染的空氣、吸煙、吸毒等都會(huì)導(dǎo)致精子DNA的碎片化程度增加。同時(shí)，高熱、工作環(huán)境溫度過高、睪丸局部血液循環(huán)受阻也是導(dǎo)致其精子DNA碎片率增高的有害因素。

3 檢測精子DNA碎片率的主要實(shí)驗(yàn)方法

3.1 末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP末端標(biāo)記法(TUNEL)：該方法于1993年由Gorczyka等首先提出，它是一種直接檢測精子DNA損傷的方法。其原理是：精子DNA斷裂是以其脫氧核苷酸鏈中的3'',5''-磷酸二酯鍵打開而產(chǎn)生5''-磷酸基團(tuán)和3''-羥基為特征的一種損傷形式，并且在適當(dāng)條件下具有一定的修復(fù)能力(斷鏈的兩端可重新連接)，因此可利用末端轉(zhuǎn)移酶將一段預(yù)先標(biāo)記好的核苷酸連接到斷裂DNA片段的3''-羥基端，然后在光鏡下或熒光顯微鏡下觀察精子DNA斷裂的情況。與其他方法相比，該方法不需要經(jīng)過對DNA的變性過程，簡單便捷，而且能同時(shí)檢測單鏈DNA和雙鏈DNA的斷裂情況，因此能夠真實(shí)地反映出精子DNA的損傷程度。所以說TUNEL法是一種值得男科實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用的方法。

3.2 單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)：又稱為彗星實(shí)驗(yàn)，它是一種在單細(xì)胞水平上檢測真核生物細(xì)胞DNA損傷的方法。該方法由Ostling和Johanson在1984年首先提出，其后經(jīng)過研究人員的不斷改進(jìn)，逐漸成為一種快速、靈敏、簡便的檢測精子DNA損傷的方法，其原理為：當(dāng)精子DNA 損傷時(shí)會(huì)出現(xiàn)不同大小的DNA 片段，經(jīng)過去污劑和裂解液處理后，精子細(xì)胞核內(nèi)的DNA碎片、大部分蛋白質(zhì)以及其他細(xì)胞成分就會(huì)滲出細(xì)胞膜進(jìn)入裂解液，然后損傷的DNA片段在電場力的作用下就會(huì)向陽極遷移，從而形成特征性的“彗星”樣拖尾，用熒光染料染色后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，從而根據(jù)彗星的頭尾長度和熒光強(qiáng)度來評估精子細(xì)胞DNA的損傷程度。后來，隨著人們對精子DNA研究的不斷深入，相繼有研究報(bào)告指出，前者實(shí)驗(yàn)條件中的中性裂解液及其溫度條件不能使斷裂的精子DNA與其精核蛋白完全分開，而只能使小部分較小片段的雙鏈DNA解離、并在電場力的作用下移出細(xì)胞核形成“彗星”樣拖尾。隨后經(jīng)過研究人員的不斷改進(jìn) ，即將電泳的條件由中性改為弱堿性，能更好地裂解精子細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，進(jìn)而能夠在電場力作用下充分地移出精子膜形成較真實(shí)的的彗星圖像，反映精子DNA 斷裂的實(shí)際水平。最近，Ribas-Maynou等采用堿性-中性雙重彗星實(shí)驗(yàn)，不僅使檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性顯著提高，而且能夠區(qū)分精子單鏈DNA碎片和雙鏈DNA碎片。

3.3 精子染色質(zhì)擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(SCD)：SCD 法首先由Ferndndez等在2003年提出。它的原理為，精子細(xì)胞經(jīng)過酸變性、去掉核蛋白后，其DNA就會(huì)從染色體上解離擴(kuò)散，如果精子核的DNA沒有損傷(不形成DNA碎片)，就會(huì)擴(kuò)散形成特征性的光暈。相反，如果精子核內(nèi)DNA受損生成碎片時(shí)，就不會(huì)產(chǎn)生這種特征性的光暈，因此可根據(jù)光暈的有無和大小判斷精子DNA的碎片率水平。后來在2005年，Ferndndez等將其方法改進(jìn)，形成一種Halosperm試劑盒，使用光學(xué)顯微鏡即可對結(jié)果進(jìn)行觀察，同時(shí)能夠保持精子尾部的完整，從而有利于人們區(qū)分精子和圓形細(xì)胞等非精子成分。因此，與其他檢測方法相比，SCD法檢測結(jié)果的組內(nèi)差異、組間差異相對較低，并且操作簡便、費(fèi)用低廉，現(xiàn)在正被國內(nèi)外越來越多的實(shí)驗(yàn)室人員所認(rèn)可和使用。

3.4 精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析(SCSA )：SCSA法已被當(dāng)前世界范圍內(nèi)大多數(shù)男科實(shí)驗(yàn)室所認(rèn)可采用，并用來評估男性生育力情況及預(yù)測體外受精和妊娠結(jié)局的關(guān)系。它的原理為：受損的精子DNA經(jīng)過酸性溶液作用后容易變成單鏈，吖啶橙(AO)與雙鏈DNA結(jié)合可發(fā)出綠色熒光，而與單鏈DNA結(jié)合發(fā)出紅或黃色熒光，然后可通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行結(jié)果分析。SCSA法現(xiàn)被稱為檢測精子DNA碎片率的金標(biāo)準(zhǔn)方法。

然而，有研究人員指出，即使人們能夠檢測出精子細(xì)胞核內(nèi)存在DNA碎片，那又能如何? 因?yàn)槟壳芭R床醫(yī)務(wù)人員還不能“尋找”出一種特別有效的能夠預(yù)防精子DNA碎片產(chǎn)生、以及精子DNA碎片產(chǎn)生后如何治療等一系列針對性措施。因此也有研究人員提出，沒有必要浪費(fèi)人力、財(cái)力去檢測精子DNA是否存在碎片，因?yàn)榧词刮覀兇_定了精子DNA有損傷，也只能是“束手無策”。而Schlegel持有不同觀點(diǎn)，因?yàn)槿绻�男性患者精子存在亞臨床損傷，含有較高的DNA碎片化指數(shù)，對醫(yī)務(wù)人員來說，這些患者的不育原因也就找到了，而不是所謂的不明原因性不育。對于以上患者，即使臨床醫(yī)生不能提供特別有效的治療方法，但是他們可以給患者一些相應(yīng)的對癥治療，例如，藥物抗氧化劑、必需微量元素補(bǔ)充治療，指導(dǎo)患者避免有害環(huán)境、毒物暴露，改正不良生活習(xí)慣(吸煙、喝酒、工作壓力、睡眠質(zhì)量差等)等有益的輔助治療措施。而這些對癥治療措施就足夠能讓一些患者從不明原因性不育的陰影中走出來而獲得成功的妊娠結(jié)局。因此，對精子DNA碎片進(jìn)行研究應(yīng)該有其重要意義。而精子DNA碎片率大小與男性生育力究竟存在何種關(guān)系，有賴于對其進(jìn)一步的探討和研究。

(張帥，張?jiān)粕剑�精�?/span>DNA碎片化在男性不育中的研究進(jìn)展[J]山西醫(yī)藥雜志2012年10月第41卷第10期上半月：1005-1007)

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