Y染色體微缺失與男性不育

　　據WHO統計,育齡夫婦中約有10 %～15 %不孕不育,其中男性少精、弱精、無精子等不育因素約占40 %～50 %[1]。引起男性不育的原因很多，如遺傳因素、內分泌因素、環境因素，但尚有一部分無精子癥及嚴重少精子癥患者原因還不明確，多表現為生精障礙，國內外研究表明，其與Y染色體微缺失有關，男性原發性無精和少精癥患者中大約有7.5 %～15 %存在Y染色體AZF(azoospermia factor)區微缺失[2]。分子流行病學研究結果顯示，中國人原發性無精與嚴重少精癥患者群體AZF區STS(sequence-tagged sites)微缺失率均高于17 %[3]。它是由于精子發生障礙而導致男性不育的最普遍的一種遺傳因素[4]。本文對Y染色體微缺失相關基因、主要原因、主要檢測方法聚合酶鏈反應(polymerase chain renction, PCR)及臨床意義進行綜述。

　　一、Y染色體微缺失

　　Y染色體是一條小的近端著絲粒染色體，約有6.0×107個堿基對。Y染色體不是人類生命所必需的，它大部分區域是隱性功能區，其中性別決定區(由SRY基因控制)被認為是Y染色體的主要區域。但隨著在Y染色體上發現精子發生控制區，這個觀點發生了改變[5]。

　　1.Y染色體微缺失主要候選區域—AZF區：1976 年Tiepolo 等[6]首次報道6例無精子癥患者有Y染色體長臂6 區(Yq6) 的缺失,包括遠端熒光區和與其相連的非熒光區,因此推測在Yq11上存在“Y染色體精子生成基因”，并由此揭開了研究Y染色體微缺失與男性不育關系的序幕。研究發現Y染色體長臂的5～6 區間有一個AZF位點,被分成3個與生育相關的功能區，AZF a區、AZF b區和AZF c區,由于這些區域包括一些影響男胚細胞發育和維持的基因和基因家族,故其可影響精子發生。最近Kent等[7]在AZF b區與AZF c區之間還發現了第4個AZF區-AZF d 區。有資料顯示，在無精子癥和嚴重少精子癥的患者中,AZF 缺失約占3 %～29 % ,它是染色體異常導致無精子以外的第2個重要因素[8]。

　　AZF存在于Y染色體長臂遠端(Yq11.23)，其微缺失可以導致精子發生阻滯。睪丸活組織檢查發現，微缺失發生于同一亞區時，精子發生阻滯在同一時相，反之，則阻滯在不同時相。一般認為AZF a區缺失的患者精子發生阻滯在青春期前階段, 表現為唯支持細胞綜合征(SCOS)和小睪丸;AZF b區缺失表現為生殖細胞成熟障礙,即睪丸內只見精原細胞和初級精母細胞,而精液中無精子;AZF c區缺失情況比較復雜，對于同一患者，一些生精小管內僅見支持細胞，而另一些生精小管內可見精原細胞、精母細胞、精子細胞甚至精子, 精液檢查為嚴重少精，有時可見少量活動精子，但畸形精子數量明顯增多;中等程度少精或精子數目正常但形態異常提示有AFZ d區微缺失[9]。

　　2.Y染色體微缺失的其他基因：精子發生是一個復雜的生理過程。生殖細胞從精原干細胞到精細胞進行有秩序的增殖、分化而產生精子, 受到大量基因調控。因此，除AZF 區外,Y 染色體長臂的SMCY 基因、短臂上的SRY、ZFY和TSPY基因也都與精子發生有關[8]。如果上述基因發生缺失或表達異常同樣會造成精子發生障礙或性腺發育障礙, 故這些基因在臨床上也有重要的意義。

　　3.Y染色體微缺失主要原因：(1)再發現象。即de novo 缺失(在患者男性直系親屬外周血分析中未見缺失)。這一缺失可能發生在其父親精子發生過程中或在其早期胚胎發育過程中。(2)垂直遺傳。主要發生在DNA 復制期，睪丸生殖細胞系缺失可產生有缺失的精子，如果這些精子使卵子受孕，將會產生Y染色體微缺失的個體,男性后代則繼承其父親生殖細胞中有缺失的染色體。(3)睪丸生殖細胞系中存在缺失的嵌合體。如父親外周血淋巴細胞中未見缺失,而通過ICSI(intracytoplasmic sperm injection)的男性后代卻有Y染色體微缺失,則說明嵌合體的存在[10]。

　　二、Y染色體微缺失的主要檢測方法

　　由于Y染色體微缺失可以導致男性不育，故其微缺失的檢測對患者的病因診斷和臨床治療及遺傳咨詢都是必要的[4]。但僅以臨床查體和精液分析為基礎的細胞遺傳學檢測不能確定Y染色體是否發生微缺失[11]，而PCR可以使少量的單拷貝基因在體外大量擴增后直接觀察，且縮短了檢測時間。因此，一般應用PCR方法檢測。1986年，Vergnaud建立了Y染色體基因微缺失圖譜[12]，為Y染色體基因分析創造了條件。接著，其他學者又列出了Y染色體上各DNA片段的PCR引物序列，為Y染色體精子發生基因的PCR檢測帶來了極大的方便。

　　1.常用的待擴增目的基因及位點：Y 染色體是男性特有的, 其上存在有精子發生相關基因。一些精子發生的候選基因在AZF區被發現，有些候選基因甚至被認為是精子發生的功能基因[4]，因此一般選擇對AZF區基因進行擴增�，F在比較公認的AZF區的候選基因是AZF c區的DAZ(deleted in azoospermia)和AZF b區的RBM(RNA binding motif)，但在PCR反應時，也可根據情況對其它兩個區進行擴增。

　　AZF c區的最佳候選區為DAZ。1995年有人發現DAZ，并證明DAZ是人和猩猩所特有的，其專一地在睪丸內表達[13]。研究表明，DAZ的表達蛋白可與RNA或單鏈DNA結合，從而調節RNA或DNA的功能。目前已發現果蠅和小鼠體內也具有DAZ的同源基因，分別被命名為Boul基因和Dazh基因，這對為深入研究人類DAZ基因的特性和功能意義創造了條件。

　　AZF b區的最佳候選區為RBM，又名YRRM(Y chromosome RNA recognition motif)。1992年我國留英學者馬昆(Ma Kun)[14]用特異性探針在50例核型正常的無精子或嚴重少精子患者中發現4例出現Yq11.23區域的基因微缺失，認為這4人的無精子可能由這些基因微缺失造成的。隨后，研究發現了MK5和MK29，均為1.9 kb左右，并證明了MK5高度專一地在人類睪丸內表達。應用基因文庫進行基因結構分析發現MK5和MK29均有編碼含RNA識別位點蛋白質的序列，因此將MK5和MK29分別命名為YRRM1和YRRM2，提示在Y精子發生初期，該基因可能參與RNA的形成、加工和翻譯等過程。

　　根據Vogt等[9]對AZF區定位結果顯示AZF a區、AZF b區、AZF c區的長度分別約為782 kb、3. 2 Mb及3. 5 Mb，且有資料顯示AZF a區缺失占全部AZF缺失的4.9 %[15]。在試驗及臨床檢測中一般進行擴增的位點是SY84，SY86(AZF a區)、SY127，SY134(AZF b區的RBM基因)、SY254，SY255(AZF c區的DAZ基因)，由于AZF d區較其他三個區發現的晚，一般在檢測中不進行，如果進行，SY152是選擇位點。研究發現，SY152位與DAZ基因的近側區，單一SY152缺失可以導致精子發生成熟期的阻滯，在睪丸活檢中不能發現精子[16]。在檢測中也可以根據實際情況選擇相應的其它位點進行擴增，如SY82(AZF a區),SY143、SY133、SY128、SY129(AZF b區),SY154、SY242、SY239(AZF c區),SY145(AZF d區)。

　　目前Y染色體微缺失檢測絕大多數是提取患者外周血，進而分離出淋巴細胞作為樣本,亦有研究者取精液或單個精子,極少研究者同時取精液和外周血。因為外周血檢測方法相對簡便、取材容易,且一般認為外周血淋巴細胞基因組DNA與胚細胞如精子基因組DNA相同[17-20]。但無論采用什么方法，患者在檢測前都要進行詳細的檢查，包括臨床檢查、生育力及家族史，以便排除其他無精癥的原因[11]。

　　在進行Y染色體微缺失檢測時，即可進行單重PCR也可進行多重PCR。單重PCR時一般選擇對AZF b區或AZF c區進行特定位點擴增，而多重PCR時一般對四個區全部進行擴增，大約10～18個位點，且AZF c區的DAZ及AZF b區的RBM所占比重較大。在多重PCR時，也可以根據實驗需要進行分組擴增。

　　2. PCR檢測主要注意事項：Y染色體PCR檢測與一般PCR過程相似，都經歷了高溫變性、低溫退火、適溫延伸，但有的學者認為在反應體系中除了正常內參照、陽性參照、陰性參照之外還應用水來做空白對照，以排除假陽性或假陰性的可能[11]。也有資料顯示，雖然水樣反應體系包含了所有的反應必須底物，卻易于被污染[21]。

　　由于檢測中不可避免出現誤差，故在結果觀察時，應保證連續3次以上PCR反應都沒有相應條帶出現，才說明其相應基因發生微缺失[11]。

　　在研究的資料中，Y染色體微缺失發生頻率有較大差異，造成這種差異的原因有多種。可能是由于，(1)病例選擇。對于病例選擇嚴格，即僅對不明原因的無精子癥和嚴重少精子癥患者進行檢測，缺失率較高。(2)實驗方法和試驗條件。實驗方法和試驗條件的好壞，直接影響到結果的可靠性。(3)檢測區域。檢測不同區域也會得出不同的缺失率;(4)人種差異[12]。

　　三、Y染色體微缺失檢測的臨床意義

　　1.確定部分無精子癥患者病因：在男性不育的患者中尚有約11 %病因不明,稱為特發性不育(idiopathic infertility) ,其中最常見的表現是無精子和嚴重少精子[4]，國內外學者認為其與Y染色體微缺失有關。

　　2. 減少病人痛苦及提高輔助生殖幾率：對于無精子癥和嚴重少精子癥患者進行Y染色體微缺失的檢測是很必要的。如果患者是AZF c區或部分AZF b區缺失，則有50%的幾率可以檢測出精子，但如果是整個AZF b區缺失，則檢測出成熟精子的可能性幾乎為零[22]。有報道表明如果患者發生缺失的部位是在AZFa 區,則沒有精子形成的可能[23]。有研究發現，AZF c區缺失的患者54%表現為無精癥，46%表現為嚴重少精癥[23];AZF a、AZF b、AZF c區同時缺失，則一定為無精癥;AZF a區完全缺失或AZF b和AZF c兩區同時缺失，96%表現為無精癥，4%表現為嚴重少精癥。因此，對于沒有可能形成精子的患者就不需要進行輔助生殖，可使患者身體和精神傷害降低，經濟負擔減少。但對于有精子形成可能的患者，就可以嘗試通過(testicular sperm extraction，TESE)進行ICSI或者(in-vitro fertilization，IVF)。

　　雖然AZF c區缺失患者有可能形成精子，但隨著時間的推移，患者的精子量會逐漸減少，那么如果在早些時候凍存患者精液，在其想生育時就可以避免睪丸穿刺的痛苦，而且精液質量也較高[22]。

　　還有資料顯示，對于無精子癥患者進行Y染色體微缺失檢測可以避免睪丸基因表達分析，而直接找到睪丸組織中成熟精子[4]。

　　3.提供遺傳咨詢：隨著現代醫學的發展，異�；�因的垂直傳播越來越被人們所接受，故那些要選擇輔助生殖夫妻的男性后代將遺傳其父親有微缺失的異常性染色體，甚至會產生更多的微缺失而導致更嚴重的睪丸表型[11]。因此，很多學者建議應向這些患者及其配偶提供遺傳咨詢服務，使他們知道后果并做出選擇，是否進行輔助生殖;是否在進行植入前直接選擇女嬰[24]。

　　總之，Y染色體微缺失的檢測非常必要，它不僅可以被定義為無精子癥的原因，還可以對那些無精子癥及嚴重少精子癥的患者及其男性后代提供大量的最適合臨床治療的寶貴信息[22]。

　　四、發展前景與新的挑戰

　　最近有學者提出，從患者口腔粘膜中提取DNA快速有效[25]，這樣不僅可以縮短檢測時間，也可以降低患者痛苦，使其損傷減少。

　　現在對于Y染色體AZF四個區的微缺失所表現的疾病類型有所了解，隨著科學技術的發展，對相應疾病表現類型進行相應區段、甚至相應位點的擴增，這樣即降低了患者經濟負擔，又可以對病因做到基因水平上的準確定位。

　　現在患者目的基因一般都來自于外周血淋巴細胞。如果外周血基因組DNA與胚細胞如精子的基因組DNA表達一致,則外周血可以代替胚細胞進行檢測，但是如果二者表達不一致,那就說明單純檢測外周血是不可信的,進行ICSI 治療的患者有必要進行胚細胞DNA 的Y染色體微缺失檢測,以明確是否攜帶有Y染色體微缺失[25]。這就需要尋求一種新的、快速、方便、有效的方法來進行檢測。

　　對于Y染色體微缺失的檢測，不僅對臨床診斷方法的發展起到推動作用，還幫助人們增長對于精子發生的知識，也許存在其它可以導致精子發生障礙的基因因子或未知精子發生基因[4]，故現在還不能從真正意義上了解和掌握與精子發生相關基因的生化功能，不能明白Y染色體微缺失的基因型和表現型之間的關系。

　　隨著科學的發展，技術的進步，對Y染色體微缺會有更深入的了解，相信以上這些問題都會得以解決。

　　參考來源：《中國生育健康雜志》2007年4月18卷3期；《Y染色體微缺失與男性不育》；韓瀟 綜述 劉睿智

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