男性不育發病機制的可能性研究

　　半個世紀以來，男性不育患者的比例有升高趨勢，但其病因和發病機制仍未完全闡明。本文結合我們的部分研究成果，概括介紹男性不育機制的部分研究熱點，著重介紹精索靜脈曲張、甲醛及男性不育相關基因與男性不育的可能關系。

　　世界衛生組織(World Health Organization, WHO)對男性不育的定義是：夫婦同居一年以上，未用任何避孕措施，由于男方因素造成的女方不孕。據報道，世界范圍內約有15%-20%的育齡夫婦不能生育[1]，且近半個世紀以來，由于環境、心理、社會等因素的影響，男性精子的數量和質量出現了明顯下降的趨勢[2��3]，男女不育的比例也已由3∶7上升到5∶5[3]，男性生殖健康正受到嚴重威脅。

　　1994年在開羅召開的國際人口與發展大會上提出“2015年人人享有生殖健康”的宏偉目標；WHO部署的21世紀生殖生物學研究的重點之一是雄性生殖生物學，男性不育是其中的一項重要內容。現代分子生物學、分子遺傳學和輔助生殖技術的發展，為男性不育機制的研究提供了新的研究思路和手段，并正取得令人可喜的進展。

　　1 男性不育的病因和發病機制

　　男性生殖參與了包括精子發生、成熟和排放，精子在女性生殖管道內的獲能，精子與卵子結合發生受精等一系列復雜的生理過程。男性生殖功能除了受到經典的下丘腦�泊贵w�残韵佥S調節以外，還受到諸如生長因子(growth factor)、抑制素(inhibin)、激活素(activin)、白細胞介素��1(interleukin��1, IL��1)、維生素A(Vitamin A, VA)等眾多生物活性因子的調控；現有研究表明，其基因水平的調控也十分復雜，原癌基因、無精癥相關基因、減數分裂基因、DNA復制相關基因、細胞周期蛋白基因、調節核蛋白轉型基因以及溫度相關基因等均參與了精子發生和成熟的調控過程；近年來一批附睪特異基因相繼被德國和美國科學家以及我國的張永蓮院士等所克隆，并逐步應用于精子附睪內成熟機制的研究，如GPX5、AEG、CRES、Bin2a、Bin1b和SC等[4��5]。上述調控因素中任一環節的失調或受到致病因素的干擾均可能影響男性生殖過程，因而使男性不育的病因和發病機制變得紛繁復雜。目前，精索靜脈曲張(varicocele, VC)引起的不育，環境及理化因素的影響，如高溫、電磁輻射、環境雌激素、重金屬、甲醛等所致的不育，內分泌性不育，免疫性不育，感染性不育以及特發性男性不育等尤其受到男科學研究者們的關注。現就其中幾個近年研究的熱點以及本中心在這幾方面研究的部分成果做一介紹。

　　1.1 精索靜脈曲張與男性不育的關系 精索靜脈曲張已經成為男性不育癥的重要原因，占男子不育癥發病率的首位[6]。精索靜脈曲張并發不育的發病率占男性不育的15%-40%，伴精液異常者占54.8%，主要表現為精子發生阻滯，精子數量減少，精子質量下降。在原發性男性不育患者中，VC的發病率約為35%，在繼發性不育患者中可達80%，且無種族差異。

　　VC與男性不育密切相關，其不育形成屬于后天獲得且有明顯的累進性特點，但迄今為止VC致不育的機理仍不十分清楚。目前的研究主要集中在VC對睪丸的影響上，如睪丸血流動力學和血管活性物質的毒性、氧化應激及生殖細胞凋亡等。Sakamoto等 [7]利用彩色多普勒超聲研究發現，與VC相關的不育者中，返向血流的存在是導致男性不育的重要原因，返向血流引起的代謝產物返流使得腎上腺、腎臟的代謝產物如兒茶酚胺類物質、前列腺素、皮質醇以及毒性代謝產物5�擦u色胺等逆流進入睪丸而影響生精過程并殺傷精子，顯著影響精子的活動力。Agarwal等 [8]總結和分析了23份關于氧化應激在VC不育中的作用的研究資料，發現VC不育男性血液中活性氧的濃度顯著增高，同時抗氧化能力顯著下降。因此，氧化應激在VC不育中被認為起著重要作用。提高患者睪丸組織的抗氧化能力可以預防VC不育的發生[9]。此外，VC時局部高溫及血液中毒性物質增加也會誘發生殖細胞凋亡的增加而導致不育。Ku等[10]研究表明凋亡在VC所致生殖細胞病理改變和生精功能障礙中起著重要作用。

　　VC對附睪影響所致男性不育的機制研究目前還沒有得到足夠重視。因而相對滯后。本中心張秋養等[11��12]在成功建立大鼠實驗性左側精索靜脈曲張(experimental left varicocele, ELV)模型的基礎上，用形態學、機能學和分子生物學等技術，比較全面系統地研究了ELV對附睪結構和功能的影響，取得了一些可喜的成果。研究表明：ELV不僅可以造成模型鼠睪丸的病理改變，而且同樣可以引起附睪的顯微和超微結構的明顯病理損傷；造成附睪內的蛋白成分、α糖苷酶活性和肉毒堿含量的明顯改變。說明VC所致不育不僅與睪丸的結構功能異常有關，也可能與附睪結構和功能的病理性改變密切相關。

　　為了深入探討附睪在VC所致男性不育中的地位，本課題組又在核酸和蛋白水平上對一些附睪基因和附睪特異基因在正常大鼠和ELV大鼠附睪中的表達進行了時空變化的研究[13��17]，即既研究了目的基因在正常大鼠發育各階段的表達變化規律，又研究了它們在附睪各區段的表達差異，并與ELV后附睪中的相應表達水平進行了詳細比較。我們已經發表和尚未發表的結果表明：

　　①血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及其受體VEGFR1和VEGFR2、Bin2a、生殖細胞核因子(germ cell nuclear factor, GCNF)、精子結合抗原11(sperm associated antigen 11, SAPG11)以及胱蛋白酶抑制劑相關的附睪精子發生因子(cystatin�瞨elated epididymal spermatogenic, CRES)等的mRNA和蛋白在大鼠附睪中均有不同程度的表達，且它們在附睪內的表達具有年齡變化特點和附睪區段和上皮細胞分布的特異性；在ELV模型大鼠附睪中，它們的表達均呈現不同程度的異常。

　　②VEGF及其受體VEGFR1和VEGFR2共表達于附睪管上皮主細胞，VEGF又高表達于上皮亮細胞。說明VEGF及其受體不僅是調節血管生長的活性因子，而且可能直接與附睪管上皮細胞的功能活動及管腔內精子的成熟過程有關。并首次證明ELV可影響大鼠附睪內VEGF及其受體的表達，其表達在ELV 4周時上調、8周時下調。說明VEGF及其受體的表達與ELV密切相關[13]。

　　③Bin2a mRNA在大鼠附睪頭部有特異性表達，且特異表達于附睪上皮主細胞，它可能直接參與主細胞的功能活動并與附睪精子成熟有關。首次證明該蛋白在ELV大鼠附睪中表達下調，其下調程度隨ELV時間的延長而加重。

　　④GCNF出現于14d齡(附睪上皮開始分化的時期)后的大鼠附睪上皮細胞核內，說明它可能與附睪上皮的分化和發育有關[14]。它可能參與那些與上皮分化和發育有關的附睪基因的表達調控過程。并證明GCNF蛋白在ELV大鼠附睪中表達下調，其下調程度隨ELV時間延長而加重。

　　⑤SPAG11C和E是SPAG11蛋白的兩個異構體，在附睪中，SAPG11主要定位于附睪管上皮主細胞的胞漿內，主細胞的靜纖毛也有弱表達，而亮細胞、暈細胞及基細胞均未見陽性染色。其中SPAG11E表達水平以附睪體部近、中段及尾部較強，而SPAG11C在附睪體部近端最強，體部中段至尾部表達逐漸減弱甚至消失；但兩者在附睪始段均未見陽性表達[15��16]。此外，它們也定位于睪丸生精上皮的圓形和長形精子細胞的頂體泡和頂體中，尤以第6-10級、第17-19級精子細胞中表達最強，而間質細胞、支持細胞、各級生精細胞以及殘余體均呈陰性染色。由此說明，它們可能既參與了精子的發生，也參與了精子的成熟過程。并首次證明ELV 2周和4周后，附睪組織中SPAG11基因和蛋白的表達均顯著下降，尤以4周組為甚；而其蛋白在睪丸中的表達在ELV 2周時增加，4周時下降，提示其可能與VC所致的不育有某種聯系。

　　⑥CRES表達于整個附睪上皮主細胞的胞漿中，附睪頭部管腔的分泌物也呈陽性，而暈細胞、亮細胞、基細胞染色為陰性。由此說明，它是附睪分泌蛋白，可能參與精子的成熟過程。此外，CRES也定位于睪丸圓形精子細胞和長型精子細胞的胞漿、頂體以及生精上皮的殘余體中，其中在Ⅸ-Ⅲ期的長型精子細胞中表達最強，在Ⅳ-Ⅵ期開始減弱，而在其他的生精細胞以及支持細胞和間質細胞中均呈陰性染色。免疫組化和蛋白印跡還表明，ELV 2周和4周后，睪丸及附睪內的CRES表達與對照組相比均有增強[17]。

　　上述基因及其表達蛋白在正常大鼠附睪或睪丸中的表達，以及它們在ELV大鼠模型相應器官內表達水平表現出的不同程度或不同區段的上調或下調，不僅說明它們的表達與附睪的結構和功能有關，而且說明VC可以引起它們在核酸或蛋白水平的表達異常。這種分子水平的變化可能進而與VC所致的繼發性不育之間產生某種聯系，但其確切機制及途徑尚未闡明，為此值得我們去做更深入的研究。

　　1.2 環境因素與男性不育的關系 隨著現代工業的發展，大量化學物質釋放到自然界中對人類居住環境造成極大的污染。環境因素，特別是環境雌激素和甲醛等有害因子與男性不育的關系因此也越來越受到研究者的重視。

　　環境雌激素：外源性化學物質通過與人體雌激素受體結合或通過影響細胞信號途徑等方式，產生模仿或部分模仿雌激素的生理作用，這類物質被稱為環境雌激素。迄今為止，已發現有70余種人工合成的化學物質顯示出不同程度的雌激素活性。按性質可以分為三類：①人工合成的雌激素，包括己烯雌酚、炔雌醇、炔雌醚等；②工業化學污染物，如烷基酚類、有機氯農藥、鄰苯二甲酸類；③生物來源的雌激素，主要來自植物和真菌，如異黃酮類。研究表明這些物質不僅可致睪丸萎縮，精子減少，甚至可引起小兒隱睪、尿道下裂、附睪囊腫和睪丸癌等病變，因而與男性不育密切相關。

　　環境雌激素對生殖系統的毒性作用機制復雜，目前較公認的作用途徑是環境雌激素干擾性激素的合成、代謝和運輸[18]，即環境雌激素進入細胞后首先與雌激素受體(estrogen receptor, ER)相結合，通過ER介導而產生相應的生物學效應，從而影響動物及人類的生殖能力。除ER外，其他受體如雄激素受體，甲狀腺素受體等都可和環境雌激素結合而影響內分泌功能。除受體模式外，某些環境雌激素如DDT，林丹等可干擾毒物代謝酶CYP1A1mRNA的表達[19]，從而干擾內源性激素的代謝，間接干擾內分泌功能。另外，植物雌激素大豆異黃酮可通過抑制拓撲異構酶而使細胞有絲分裂停滯并導致染色體畸變[19]。雙酚A可引起支持細胞凋亡，干擾和減弱支持細胞對生精細胞的支持和營養作用，從而影響精子發生和發育[20]。總之，由于環境雌激素種類繁多，其生殖毒性作用機理也多樣化。

　　甲醛：調查顯示，城市居民每天在室內工作、生活和學習的時間長達21.53h，占全天時間的92%[21]，人類社會已進入以“室內空氣污染”為特點的第3次污染時期[19]。室內空氣污染的主角是甲醛。甲醛在室內主要來源于建筑材料、家具、各種粘合劑涂料、墻壁裝飾材料、合成織品(如地毯、裝飾品)及化妝品、清潔劑、殺蟲劑、防腐劑以及煤爐、液化氣的燃燒、藏書的釋放等。室外空氣中的甲醛主要來自石油、煤、天然氣等燃料的燃燒，潤滑油的氧化分解，汽車尾氣排放，大氣光化學反應，以及生產甲醛、尿醛樹脂、化學纖維、染料、橡膠制品、塑料、墨水、噴漆、涂料的工廠等地。此外，研究表明，甲醛的釋放是一個持續過程，釋放時間可持續3-15年[22]。中華人民共和國國家標準中《居室空氣中甲醛的衛生標準》規定，甲醛應小于或等于0.08mg/m3。但是，我國目前新裝修和裝修過的場所(居室、辦公室、商場等)普遍存在甲醛含量超標的現象。

　　Mcgregor等[23]研究發現甲醛的前體吸入可誘導雄性大鼠間質細胞腺瘤的發生。Karimov等[24]在雄性大鼠低劑量吸入甲醛混合氣體一個月后發現，混合氣體可引起部分大鼠精原細胞數量減少，生精上皮結構紊亂，生精周期破壞等現象。Oguz等[25]研究發現甲醛吸入可引起雄性Wistar大鼠生長遲緩，睪丸組織微量元素銅、鋅含量下降。因為銅、鋅是睪丸組織抗氧化酶的重要輔基，所以銅、鋅含量的下降可使睪丸組織抗氧化能力下降，進一步誘導睪丸組織氧化損傷而引起不育。

　　我們從以下幾個方面深入研究了甲醛的生殖毒性[26��27]：①對精子的影響，經過不同途徑(經腹腔注射、呼吸道吸入)對雄性SD大鼠甲醛染毒后，精子的活動度及生存能力均減弱，精子計數也明顯減少，精子的畸形率明顯增加，并且精子的變化有一定的劑量依賴性。②對睪丸生殖細胞的影響，研究顯示甲醛可以使生精周期紊亂，曲細精管數量減少，生精上皮變性和壞死。③從致毒機制研究方面，發現一定劑量甲醛的生殖毒性使大鼠睪丸發生脂質過氧化損傷，抗氧化酶減少，而過氧化物質增加，使睪丸的抗氧化能力降低，氧化損傷后引起DNA和蛋白質交聯，而影響相關基因的正常表達。另外，甲醛染毒后引起睪丸生殖細胞凋亡率增加，以及影響支持細胞和間質細胞相關基因的正常表達等都可能參與了甲醛的致毒機制。

　　1.3 男性不育相關基因 研究顯示，約有10%-15%男性不育是由染色體缺失和或基因突變引起的[28]。隨著人類基因組測序的完成和功能基因組計劃的開展，為研究男性不育的基因機制及它對睪丸、附睪功能的影響提供了條件。

　　1.3.1 性染色體與生精基因的缺失與突變[29��30] 研究發現的Y染色體上的AZF基因(azoospermia factor)、RBMY基因(RNA binding motif on the Y)、DAZ基因(deleted in azoospermia)和CDY1(chromodomain Y1)、BPY2(basic protein Y2)、PRY(PTABL related Y)和TTY2(testis transcript Y2)基因等可能與男性不育有關。X染色體上的雄激素受體(androgen receptor, AR)基因、泛素蛋白酶26(ubiquitin�瞫pecific protease 26, USP��26)基因突變也與男性不育有關。

　　近年的研究熱點主要集中在AZF基因和X染色體上的相關基因。AZF基因定位于Yq11。這一區域的異常和大多數原發性無精子癥的發生密切相關。1996年Vogt等將Y染色體長臂上主導精子形成的區域分為AZFa、AZFb、AZFc等三區，這三區染色體上的基因分別主導精子形成過程中的不同階段，AZFa的基因主導精母細胞的增生，故AZF基因缺失者病理表現為唯支持細胞綜合征。AZFb基因(DAZsY134)缺失，病理發現生殖細胞成熟停滯；AZFc區(DAZsY254)基因缺陷可造成無精子癥，也可造成精子極度稀少癥。后來又發現了AZFd區。

　　X染色體上的AR基因定位于Xq11-12，包含8個外顯子。AR在男性精子細胞分化過程中起著關鍵性作用。目前的研究熱點是1號外顯子，其上有兩個多態位點，分別為CAG和GGC重復序列。另一基因USP��26(泛素蛋白酶26)定位于Xq26.2，特異表達于睪丸組織。該基因的突變與男性特發性不育癥密切相關[28��30]。

　　從本中心對中國特發性男性不育患者進行的X染色體上USP26基因多態性研究表明，22.0%(9/44)的受檢者的USP26基因發生突變，其中8人(19.5%)是復合突變(420位插入ACA，512位G被A置換)，1人(2.4%)是1096位的T被A置換(圖1、2)。同時，512位的G→A置換也見于20%(3/15)的正常對照組。上述三種變化均可導致編碼氨基酸的改變。由此說明，USP26基因在男性生殖中可能具有重要作用，USP26 基因突變可能與中國男性特發性不育有關[31��32]。

　　1.3.2 常染色體基因的缺失與突變[28,31] 研究發現DAZL基因、SYCP3基因、tsMCAK(KIF)基因、CSTF2T基因、MTHFR(亞甲基四氫葉酸還原酶)基因、ER(雌激素受體)基因、CFTR基因和CATSPER2基因等可能都與男性不育有關。

　　DAZL(DAZLA)基因被認為是DAZ基因的祖先基因，定位于3號染色體2區4帶。Lin等人的研究顯示，DAZL基因的轉錄水平在一些男性中明顯降低，如精子發生過少，精子成熟停滯，唯支持細胞綜合征等，且實驗證明DAZL基因對精子形成過程中的有絲分裂和減數分裂起著重要作用。

　　SYCP3基因定位于12號染色體上，包含9個外顯子，長約10.8kb，編碼DNA結合蛋白。Miyamoto等研究結果顯示該基因特異表達于睪丸組織中，是精子發生的必需基因。

　　tsMCAK(KIF)基因定位在1p34，含有20個外顯子，它是基因HsMCAK的剪接變體，同時也是驅動關聯蛋白(KPPs)的新成員。Cheng等研究證實tsMCAK基因可以干擾細胞的有絲分裂和減數分裂而影響精子發生。CSTF2T基因定位于10q22-23，長約2324bp，無內含子，編碼的蛋白質包含616個氨基酸。Dass等研究結果顯示，CSTF2T基因在睪丸組織中表達，且最有可能表達于生殖細胞。

　　MTHFR基因定位于1p36.3。有研究表明，MTHFR基因677位突變，C被T置換，編碼的丙氨酸(Ala)被纈氨酸(Val)置換與特發性少精子癥有關。

　　ER基因：雌激素通過雌激素受體發揮作用。雌激素受體包括ERα 和ERβ，編碼基因分別定位于染色體6q25.1和14q22-24。ERα和ERβ可以形成異二聚體，激活磷脂酰肌醇��3激酶途徑，共同控制精子存活。

　　CFTR基因定位于7q31。據報道，復合雜合子中CFTR基因P1290S錯義突變與先天性輸精管缺失癥(CBAVD)和囊性纖維病(CF)密切相關。

　　CATSPER2基因定位于15q15。Avidan等人在克隆先天性紅細胞生成不良性貧血基因時，從法國一家系中發現，3個兄弟除患有該病外，還合并弱畸形精子癥及耳聾。

　　綜上所述，男性不育癥并非是一種獨立的疾病，而是多種因素綜合作用的結果，積極探討男性不育癥的病因，對防治男性不育，促進男性生殖健康將起到非常重要的作用。

　　2 展望

　　盡管對男性不育的研究已經有了大量的臨床和實驗基礎的積累，但由于人類生殖的復雜性，人類對自身生殖的了解仍然非常有限，人類生殖還有很多未解之謎。相信隨著分子生物學、分子遺傳學和人類輔助生殖技術的發展，很多謎底都將被揭開，男性不育的機制和診治終將會得到圓滿的解決。

　　參考來源：《西安交通大學學報》2007年8月28卷4期；《男性不育機制部分研究熱點的探討》；邱曙東，周黨俠

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