男性不育患者精漿NO的含量對生精細胞凋亡的影響

　　一氧化氮（NO）具有自由基化學性質和多種生物功能。NOS(nitric oxide synthase)廣泛存在于人類生殖系統各組織，參與男性生殖系統功能的調節，如精子的發生、成熟及精原細胞凋亡等。NO通過調節睪丸血供及激素分泌、影響精液質量，降低精子細胞的運動能力，影響生殖功能。 關于男性不育患者NO含量與生精細胞凋亡的關系目前報道極少，我們檢測80例男性不育患者精漿NO的含量，觀察NO的含量與生精細胞凋亡的關系,旨在進一步探討男性不育發生的機制。

　　目的：探討在男性不育中精漿NO含量對生精細胞凋亡的影響。

　　方法：應用硝酸還原酶法測定80例男性不育患者和62例正常有生育能力的健康男性（正常對照）精漿NO的含量；應用TdT介導的原位末端標記法檢測15例男性不育患者、12例精漿NO的含量超過135 μmol/L的不育患者和15例正常健康男性的生精細胞凋亡情況；電鏡觀察不育患者生精細胞凋亡的超微結構變化。

　　結果：不育組與正常對照組精漿 NO含量分別為(107.8±25.9)和(76.5±16.4) μmol/L，差異極顯著（t=8.34，P<0.01）；15例正常生育組精漿NO含量為(76.7±10.4) μmol/L，生精細胞凋亡率為(3.8±1.3)%；15例不育組NO含量為(112.7±14.3) μmol/L，生精細胞凋亡率為 (4.7±1.9)%；12例不育組精漿NO含量高(>135 μmol/L)者的生精細胞凋亡率為（16.3±4.0）%. 不育組精漿NO含量和生精細胞的凋亡率均高于正常對照組（P<0.05). 不育組精漿NO含量超過135 μmol/L者的生精細胞凋亡率與正常對照組比較兩者差異極顯著（P<0.01）。 電鏡觀察發現，不育患者生精細胞出現核染色質濃縮、電子密度升高、核膜折疊、核裂解、形成凋亡小體等一系列變化。

　　結論：NO含量異常升高使生精細胞凋亡增加而降低生育能力。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　199805/200303泰安市各醫院及章丘市人民醫院收治的男性不育患者80例,年齡24～41（平均29.3±3.1）歲,婚齡2～12（平均5）a. 育齡夫婦結婚2 a以上，性生活正常，雙方均未采取任何避孕措施，無嚴重軀體性疾病；排除隱睪癥、腮腺炎、內分泌系統疾病,無接觸放射線等因素所致的不育；女方無明顯不育因素。正常男性生育組62例，身體健康，有正常生育史，無生殖道疾病，精液常規正常，年齡23～39（平均28.3±3.0）歲。檢測病例禁欲3~5 d，手淫法取精液于潔凈容器中，置37℃恒溫箱中待液化后進行檢測。

　　1.2方法

　　1.2.1NO含量檢測用硝酸還原酶特異性將NO3還原為NO2，通過顯色深淺測其NO2濃度的高低，間接反映NO的水平. 操作過程:取待檢精液0.1 mL，然后嚴格按照試劑盒說明書專人操作。用分光光度計（上海第三分析儀器廠生產）于550 nm，0.5 cm光處,測定樣品的吸光度A值,根據下列公式計算NO含量。 NO（μmol/L）＝（測定管的A值-空白管的A值）/（標準管的A值-空白管的A值）×100 μmol/L×樣品的稀釋倍數. NO測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

　　1.2.2生精細胞凋亡檢測取液化的精液2 mL緩慢加入到底部已有2 mL 450 mL/L percoll液的試管中，2000 r/min，離心20 min，取精液與450 mL/L percoll分離液交界處的細胞層，加入等量的生理鹽水混均，1500 r/min，離心10 min，棄上清，沉淀用生理鹽水配成1∶5濃度的細胞懸液。取細胞懸液一式兩份各10 μL，一份涂在干凈的玻片上（細胞形態觀察用），另一份涂在有多聚賴氨酸的玻片上（TUNEL檢測用），剩余細胞懸液放入戊二醛固定液中，用于電鏡觀察。另取一張已制備好的細胞涂片進行HE染色，鏡檢。TdT介導的原位末端標記法檢測凋亡細胞：按照試劑盒說明書專人操作。細胞凋亡試劑盒購自南京建成生物工程研究所; 鏡下凋亡細胞的核中有棕褐色顆粒，非凋亡細胞用蘇木素染為藍色。細胞體積縮小，致密染色質聚集，斷裂成核碎片，形成膜包裹性的凋亡小體。取戊二醛固定的細胞，經磷酸緩沖液沖洗，餓酸固定，乙醇梯度脫水，用Epon812樹脂浸透包埋，LKB型超薄切片機切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，在透射電鏡（JEM1200，日本）下觀察。

　　統計學處理： 應用SPSS 10.0統計分析軟件，進行方差分析和t檢驗。

　　2結果

　　不育組與正常對照組精漿 NO含量分別為(107.8±25.9)和(76.5±16.4) μmol/L，差異極顯著（t=8.34, P<0.01）。 分離的生精細胞出現細胞核固縮，在核周聚集，出現境界分明的新月形或塊狀小體。凋亡的生精細胞在凋亡的初始階段出現核膜間隙增寬，核電子密度增高，核膜與胞膜分離（Fig 1A）；核膜折疊，互相融合（Fig 1B）；胞膜與核膜裂解，核移外吐（Fig 1C）。

　　不育伴NO含量升高（>135 μmol/L）患者12例（C組）生精細胞的凋亡率明顯高于A組(15例正常有生育能力的健康男性)和B組(15例不育患者)（P<0.01);B組與A組間有顯著性差異（P<0.05, Tab 1)。不育患者精漿中NO的含量與生精細胞的凋亡率呈正相關(r=0.85, P=0.001)。提示NO的濃度對精子的形成有一定影響。表1NO含量與生精細胞凋亡率（略）

　　3討論

　　eNOS位于所有生精階段的間質細胞和支持細胞胞質。而在附睪和輸精管上皮細胞中也發現有eNOS分布。 正常生精細胞中未發現有eNOS的分布，但在凋亡的精母細胞中有高濃度的eNOS表達。本結果表明，男性不育組精漿NO含量明顯升高者生精細胞凋亡率與正常對照組比較差異極顯著（P<0.01)。相關分析發現不育組精漿NO含量與生精細胞凋亡率呈正相關（r=0.85, P=0.001)。提示NO含量異常升高使生精細胞凋亡增加從而降低生育能力。NO通過脂質過氧化作用誘導生精細胞凋亡；NO能與睪丸生精細胞中的含鐵酶相互作用，抑制生精細胞線粒體呼吸和能量產生；抑制與DNA合成有關的酶，使DNA合成減少;直接啟動p53的表達。

　　電鏡觀察發現，男性不育患者生精細胞出現核染色質濃縮、電子密度升高、核膜折疊、 融合或裂解等一系列變化。對男性不育患者生精細胞的超微結構的觀察，可進一步了解其不育的發生機制，對臨床診斷和治療提供病理形態依據具有重要的意義。

　　參考來源：《第四軍醫大學學報》2004年10月25卷19期；《男性不育患者精漿NO的含量對生精細胞凋亡的影響》；于愛蓮，柳雅玲，張風雪，李亞魯，趙英會

TAG：男性不育 男性不育患者精漿NO的含量對生精細胞凋亡的影響