沙眼衣原體感染與精子凋亡關(guān)系

　　男性生殖道的感染是引起男性不育的重要的因素，在癥狀或非癥狀男性生殖道感染中，起關(guān)鍵作用的兩種生物體是解脲支原體(mycoplasma urealytium;MU)和沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis;CT)。近年來(lái)，關(guān)于MU感染與男性不育的關(guān)系已有大量的報(bào)道，但CT感染對(duì)精子及男性不育的影響報(bào)道不多[1～3]， CT感染引起男性不育的機(jī)制仍不清楚。據(jù)WHO報(bào)道，每年全球約5億人新發(fā)性傳播疾病，其中的18％是由CT感染造成[4，5]。在女性中，年輕、性活躍者是生殖道CT感染的好發(fā)人群，在CT的傳播中具有重要作用；在男性中，泌尿生殖道CT感染率不易確定，其原因是CT感染不易作微生物學(xué)檢查或?yàn)闊o(wú)癥狀者。細(xì)胞凋亡（apoptosis）是細(xì)胞在胞外或胞內(nèi)信號(hào)誘導(dǎo)下發(fā)生的主動(dòng)自殺死亡過(guò)程，是調(diào)控機(jī)體發(fā)育、維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡過(guò)程。關(guān)于精子凋亡與男性不育的關(guān)系已有報(bào)道[6]。為明確CT感染引起男性不育的機(jī)制，于2007年對(duì)精液CT感染與精子凋亡之間的關(guān)系進(jìn)行了探索。

　　目的： 探討精液沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,CT)感染與精子凋亡的關(guān)系，為研究男性不育提供新思路。

　　方法： 沙眼衣原體的檢測(cè)用免疫層析法，采用瑞－姬染色精子，觀察精子形態(tài)變化；用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的脫氧核苷酸原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)凋亡精子。

　　結(jié)果： 精液CT陽(yáng)性組精子凋亡率（33.03±14.98）％，正常對(duì)照組精子凋亡率為（9.68±2.78）％，組間差異顯著（P＜0.01）。

　　結(jié)論： 精液CT感染導(dǎo)致精子凋亡率增加，CT感染可能是男性不育的重要原因之一。

　　1 材料與方法

　　1.1 研究對(duì)象

　　正常對(duì)照組15例，有正常生育史，身體健康，精液CT檢測(cè)陰性，精液常規(guī)正常的自愿捐精子者；年齡24～32歲，平均（27.73±2.20）歲。CT陽(yáng)性組57例，不育門(mén)診就診者，為婚后同居2年以上，有正常性生活，未采用任何避孕措施，睪丸、附睪、內(nèi)分泌、染色體等檢查無(wú)異常；精液CT檢測(cè)陽(yáng)性，年齡24～40歲，平均（28.81±3.31）歲，不育年限2～10年，平均（4.37±2.70）年，其配偶檢查無(wú)異常。

　　1.2 試劑

　　TUNEL 細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒由南京凱基生物技術(shù)有限公司提供，CT快速免疫檢測(cè)試劑盒由英國(guó)Unipath公司提供，1×Earle’s和10×Earle’s液由Sigma公司提供，percoll原液由南京凱基生物技術(shù)有限公司提供，TritonX��100由北京拜爾迪生物公司提供。

　　1.3 研究方法

　　所有研究對(duì)象均禁欲3～5 d，手淫法收集全程精液于無(wú)菌玻璃容器中，置于35 ℃恒溫恒濕箱中液化。取液化后的精液2 ml加入底部有2 ml 45%Percoll液的離心管中，2 000 r/min離心10 min，精液細(xì)胞主要沉積于精漿和45％Percoll液之間，于精漿與45％Percoll液之間用移液器取50 μl×5次精液沉淀入另一組離心管中，加入2 ml生理鹽水，充分混勻；1 500 r/min離心10 min棄上清液，加入生理鹽水2 ml；充分混勻后，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入生理鹽水2 ml；充分混勻后，1 500 r/min，離心10 min棄上清液，加入3 ml生理鹽水，充分混勻，配成一定濃度的細(xì)胞懸液。取制備好的精液細(xì)胞懸液50 μl分別滴加在普通潔凈的玻片（瑞姬染色用）和多聚賴氨酸防脫玻片（TUNEL時(shí)用）上，用采血針推平，棄去多余的細(xì)胞懸液，平放、自然涼干。

　　1.4 CT檢測(cè)

　　取液化后的精液1～2 ml，1 500r /min離心10 min，取沉淀，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

　　1.5 常規(guī)形態(tài)學(xué)染色

　　取制備好的普通玻片精液細(xì)胞樣本，浸入瑞－姬染液中1 min，倒入等量pH6.9的PBS緩沖液，再染10 min，自來(lái)水沖洗，自然涼干后用光學(xué)樹(shù)脂封片，置油鏡下檢查并拍照。

　　1.6 TdT介導(dǎo)的TUNEL法檢測(cè)凋亡精子

　　取已制備好的多聚賴氨酸防脫玻片精液細(xì)胞樣本浸入固定液，室溫15～25 ℃固定15 min～1 h；-20 ℃的乙醇中放置2 h；PBS漂洗3次，每次5 min；浸入封閉液，室溫15～25 ℃封閉10 min；PBS漂洗3次，每次5 min；浸入通透液中，冰上（2～8 ℃）促滲2 min。PBS漂洗兩次，樣本周?chē)�用吸水紙吸干；每個(gè)樣本滴加50 μl TdT酶反應(yīng)液，加蓋玻片37 ℃避光濕潤(rùn)反應(yīng) 60 min；PBS漂洗3次，樣本周?chē)�用吸水紙吸干；滴�?0 μl Streptavidin�睭RP�补ぷ饕海�加蓋玻片37 ℃濕潤(rùn)避光反應(yīng)30 min；PBS漂洗3次；滴加50 μl DAB工作液，室溫顯色反應(yīng)10 min；PBS漂洗3次，光學(xué)顯微鏡下檢測(cè)及拍照。

　　1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，結(jié)果用（x±s）表示。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 精子周亡率

　　觀察精子頭尾部，計(jì)數(shù)凋亡精子，統(tǒng)計(jì)凋亡率（計(jì)數(shù)500個(gè)精子，計(jì)算凋亡精子數(shù)占總精子數(shù)的比例），正常對(duì)照組精子凋亡率為（9.68±2.78）％，CT陽(yáng)性組精子凋亡率達(dá)到（33.03±14.98）％。

　　2.2 TdT介導(dǎo)的TUNEL法檢查凋亡精子

　　隨機(jī)觀察正常對(duì)照組和CT陽(yáng)性組精液標(biāo)本，凋亡精子頭部呈棕黃色（圖1～4)，未凋亡精子不著色。

　　2.3 瑞－姬染色檢查凋亡精子 凋亡精子染色質(zhì)固縮（圖5），核邊集、呈新月?tīng)罨驂K狀小體（圖6）。

　　3 討論

　　CT是一類(lèi)專性細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)、有獨(dú)特發(fā)育周期的原核細(xì)胞型微生物，很少?gòu)恼�常男性尿道中分離出來(lái)，但被認(rèn)為是非淋菌性尿道炎（NGH）、附睪炎和慢性前列腺炎的主要病因之一，其對(duì)男性生育功能的影響已引起了人們的關(guān)注。研究結(jié)果顯示，CT陽(yáng)性組和正常對(duì)照組精子凋亡率分別為（33.03±14.98）％和（9.68±2.78）％，組間差異顯著，表明精液CT感染導(dǎo)致精子凋亡率增加。CT感染可刺激巨噬細(xì)胞分泌IL��1、LI��6及TNF��α等細(xì)胞因子[7，8]，而TNF��α是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞因子；同時(shí)，TNF��α增高后使轉(zhuǎn)移單電子的還原型輔 圖1 CT陽(yáng)性組少精子組（TUNEL法，酶Ⅱ氧化酶含量增多，產(chǎn)生一系列的活性氧化物質(zhì)（ROS）。過(guò)量的ROS，一方面可使精子線粒體內(nèi)、外膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使膜的脂質(zhì)排列松散，內(nèi)膜脊減少，ATP合成降低；另一方面過(guò)量ROS還可引起精子核的DNA發(fā)生斷裂，導(dǎo)致精子凋亡的增加。Darville等[9]研究小鼠生殖道抗CT感染機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在抗CT感染的宿主免疫應(yīng)答中存在細(xì)胞介導(dǎo)免疫。Spadafora[10]研究證實(shí)生精細(xì)胞通過(guò)CD4分子介導(dǎo)免疫后，具有自發(fā)攝取外源性DNA能力，精子與外源性DNA相互作用，刺激內(nèi)源性核酸導(dǎo)致類(lèi)似凋亡的細(xì)胞死亡過(guò)程。

　　細(xì)胞凋亡(apoptosis)是多細(xì)胞生物普遍存在的細(xì)胞死亡形式之一。有研究顯示，在生長(zhǎng)發(fā)育、組織代謝和一些疾病等許多生理和病理過(guò)程中，凋亡都發(fā)揮著極為重要的作用。目前檢測(cè)凋亡的方法很多,其中原位末端標(biāo)記技術(shù)TUNEL法是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法,可對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞或凋亡小體進(jìn)行原位染色,能準(zhǔn)確反映細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征。DNA裂解為許多單或寡核苷酸片斷是細(xì)胞凋亡的主要生化標(biāo)志。由于正常的、或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA的斷裂，故很少能夠被染色[11]。應(yīng)用TdT介導(dǎo)的TUNEL法檢測(cè)正常對(duì)照組和CT陽(yáng)性組精液標(biāo)本，凋亡精子呈棕黃色，而未凋亡精子不著色。在應(yīng)用TdT介導(dǎo)的TUNEL法檢測(cè)凋亡精子的同時(shí)，應(yīng)用常規(guī)瑞－姬氏染色法從另一角度檢測(cè)凋亡精子，發(fā)現(xiàn)凋亡精子核染色質(zhì)固縮并核周聚集，呈境界分明的新月形或塊狀小體；胞質(zhì)起泡，胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng)等形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，與熊承良等[12]報(bào)道一致。萬(wàn)長(zhǎng)春等[13]研究表明，由于常規(guī)形態(tài)學(xué)方法不能早期發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞核與細(xì)胞器的改變, 故凋亡細(xì)胞百分率常規(guī)形態(tài)學(xué)染色法低于TUNEL 法, 但二者差異不顯著(P>0.05)。

　　研究表明，精液CT感染導(dǎo)致了精子凋亡率增加，CT感染可能是導(dǎo)致男性不育的重要原因之一。

　　參考來(lái)源：《貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)》2009年6月34卷3期；《沙眼衣原體感染與精子凋亡關(guān)系的初探》；楊丹，鄭立宏，高曉勤，石家齊

TAG：男性不育 精子凋亡 沙眼衣原體感染與精子凋亡關(guān)系