Y染色體微缺失與男性不育相關

　　全世界約15%的夫婦不育，男性不育占50%左右，其中60%以上精子發生減少的原因不清，認為有遺傳變異存在［1］ .近來發現Y染色體微缺失，主要是AZF基因缺失與之有關.我們采用多重PCR技術，對45例研究對象精液基因組DNA進行Y染色體微缺失檢測，旨在從分子水平對男性不育病因作一些探索.

　　目的：探討Y染色體微缺失與原因不明性無精癥、少精癥所致男性不育的相關性.

　　方法：特發性少精癥18例、特發性嚴重少精癥12例、特發性無精癥5例及正常已生育健康男性10例作為研究對象和正常對照.應用多重PCR技術，對精液基因組DNA進行Y染色體上連續的18個序列標記位點檢測.

　　結果：少精癥18例中發現Y染色體微缺失2例，嚴重少精癥12例中發現Y染色體微缺失3例.無精癥5例和正常已生育男性10例均末發現Y染色體微缺失.缺失形式3種.

　　結論：Y染色體微缺失與精子發生障礙相關.

　　1 對象和方法

　　1.1 對象 2001-03/2001-11西京醫院婦產科不孕不育專科門診患者35例.其中特發性少精癥18例，特發性嚴重少精癥12例，特發性無精癥5例.平均年齡33（26～39）歲，婚后不育年限1.5～8（平均3.5）a.所有患者性功能正常，無生殖系統器質性病變及炎癥、阻塞等.10例正常對照精液標本為西京醫院婦產科實驗室儲存，平均年齡27.5（22～35）歲.所有研究對象在檢測前抽靜脈血檢查染色體核型（G顯帶技術）、抗精子抗體（ELISA）及血清激素水平（卵泡刺激素、黃體激素、睪酮，放射免疫測定法），異常者均不列入研究對象.

　　1.2 方法 精子密度判斷根據1992年WHO標準制定，采用北京偉力經貿公司WLKY-9000偉力彩色精子質量檢測系統進行檢測.研究對象禁性生活3d后，取精液檢查，連續2次異常予以確診.無精癥:精液中未見精子;嚴重少精癥:精子密度小于5×109 ?L-1 ;少精癥:精子密度（5～20）×109 ?L-1 .精液基因組DNA提取采取氛氯仿抽提法.精液標本離心棄上清，生理鹽水洗滌后，加入細胞稀釋懸浮液、10g?L-1 SDS，3mol?L

　　-1 氯化鈉、雙蒸水和酚氯仿（V∶V∶V∶25∶24∶1），離心取上層，加無水乙醇離心，75mL?L-1 乙醇洗滌，雙蒸水溶解DNA.紫外分光光度計及20g?L-1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定其純度及含量.提取的DNA置-20℃保存.缺失篩查采用美國Promega公司生產的Y染色體缺失檢測系統（Y chromosome Deletion Detection System，Versisn1.1Part#TM234），其包含有Y染色體上與精子生成基因最相關的18個已知序列標記位點引物對.同時擴增18個非多態序列標記位點短DNA片段（分別位于AZFa AZFb AZFc AZFd區域，Fig1）.擴增產物長度為83～370bp，瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色觀察.試劑盒提供對照梯度標準物.檢測系統分A，B，C，D4組反應液，每組內均有一對照引物擴增X連鎖的SMCX位點，以作為擴增反應效果和DNA完整性對照.另外設正常男性DNA陽性對照及空白陰性對照.如果測試樣品不能擴增出Y染色體特定區域，則意味著測試樣品Y染色體有該區域微缺失.初篩異常標本經2～3次PCR重復檢測證實.PCR總反應體積25μL，循環條件:94℃2min，94℃1min，57℃30s，72℃1min，35個循環，最后72℃延伸5min，4℃保溫.擴增產物在20g?L-1 瓊脂糖凝膠，1×TBE緩沖液及5V?cm-1 電流條件下電泳.經UV-150紫外線透射分析儀照射后，復日科技FR-2000紫外與分析可見裝置掃描成像.

　　2 結果

　　35例異常精液標本除5例無精子癥外，余30例少精癥中28例伴有精子活率低下，精子活率范圍3.0%～46.6%，平均25.3%.10例對照男性其精子數量及活率正常.所有精液標本采用氛氯仿抽提法提出了精液基因組DNA，經多重PCR擴增，電泳顯示特異性SMCX帶（83bp），示多重PCR擴增反應有效，提取的DNA具有完整性.35例患者精液基因組DNA經多重PCR擴增檢測后發現5例有Y染色體微缺失，缺失率14.3%，其中2例為少精癥，3例為嚴重少精癥.5例無精癥患者和10例對照男性未發現Y染色體微缺失.缺失表現形式3種:1例AZFc（DAZ+SY157）+AZFb（SY130+SY128）缺失;1例AZFc（DAZ+SY157）+AZFd（SY152）缺失;余3例均為AZFc缺失（Fig1，Tab1）.5例缺失患者均有AZFc缺失，無AZFa缺失，亦無AZFb和AZFd單獨缺失.AZFc缺失片段各不相同，但包含有共同缺失片段DAZ（SY254，SY255，Fig1，2）.

　　圖1 略

　　表1 Y染色體微缺失患者缺失部位、片段及精子密度、活率　略

　　3 討論

　　我們發現35例不明原因性無、少精癥患者中有5例顯示Y染色體微缺失，10例正常對照無一例發現微缺失，提示Y染色體微缺失與男性精子發生相關.Y染色體微缺失發生率報道不一［2，3］ .Foresta等［4］ 分析不育男性4800例Y染色體基因微缺失，發現無精癥男性缺失率最高，其次是嚴重少精癥和少精癥.我們的結果只發現嚴重少精癥缺失率高于少精癥，5例無精癥患者無一例發現微缺失，與無精癥患者樣本量少可能有關.我們研究表明，缺失最多的部位亦為AZFc區中的DAZ基因，且所有DAZ基因缺失患者均有共同缺失片段:DAZ基因簇中的SY255和SY254，提示此兩基因參與精子的發生.

　　圖2 略

　　關于Y染色體微缺失的機制說法不一，主要認為:①Y染色體在精子發生過程中，由于胚細胞快速分裂，與卵子發生過程相比具有更多突變機會;②Y染色體不能象常染色體一樣進行DNA修復;③所有Y染色體基因都是單倍體，故一個基因缺失就能發生效應［3］ .但也有學者持相反觀點:認為Y染色體微缺失形成是一種隨機事件，不依賴于Y染色體出現的背景，可能是其它遺傳或環境因素所致，Y染色體微缺失是導致男性無、少精癥的重要原因.

　　參考來源：《第四軍醫大學學報》2002年7月23卷14期；《Y染色體微缺失與男性不育相關》；劉芳　陳必良　蘇明權　王德堂

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