反復自然流產與精子DNA完整性的相關性

　　反復自然流產（recurrent spontaneous abortion, RSA）的發生率為1%-5%,其發病機制尚未完全闡明，可能與解剖異常、免疫失調、內分泌紊亂、染色體異常、感染及基因多態性等有關，由于其發病原因不明，給臨床治療帶來困難[1-4].

　　精子DNA是精子遺傳物質的載體，近年來的研究表明精子DNA的完整性能夠影響精子的受精能力、受精卵的分裂以及胚胎的發育[5-7].為了評估精子DNA完整性在反復自然流產中的可能作用，我們對反復自然流產患者丈夫精子DNA完整性和正常生育男性精子DNA完整性進行了檢測，并比較了兩組間在精子DNA完整性和精液常規方面的差異。

　　目的：探討反復自然流產與精子DNA完整性的相關性。方法：按納入標準將研究對象分成反復自然流產患者丈夫組（n=58）和正常生育男性對照組（n=50），采用吖啶橙實驗（AOT）對研究對象精子DNA完整性進行檢測，并對研究對象精液進行常規分析。結果：兩組研究對象年齡、吸煙史、飲酒史無統計學差異（P>0.05）；反復自然流產患者丈夫組精液的精子密度、精子活力顯著低于正常生育對照組（P<0.05）；反復自然流產患者丈夫組精子DNA的完整性低于正常生育對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：精子DNA完整性損傷是反復自然流產的可能原因，精子DNA完整性損傷導致反復自然流產的致病機理尚需進一步研究。

　　1 對象與方法1.1 研究對象 本組58例反復自然流產患者丈夫（反復自然流產組），年齡25-36歲，來自西安交通大學醫學院第一附屬醫院男科門診；50例正常生育男性自愿者作為對照組（正常對照組），年齡24-33歲，其配偶至少有一次生育史且無自然流產史。反復自然流產患者的納入標準參照Buchholz等[8]的標準。對研究對象的年齡、飲酒史、吸煙史等基本資料進行統計，以平均每日吸煙超過10支，連續吸煙6個月及以上為吸煙，以平均每日飲酒量50 mL（純乙醇量），連續6個月及以上為飲酒。

　　1.2 主要試劑與儀器 WLJY-9000偉力彩色精子質量檢測系統（北京偉力新世紀科技發展有限公司），熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），吖啶橙（美國Sigma公司）。

　　1.3 標本采集 受檢者應禁欲3-7 d,用手淫或體外排精法收集一次排精的全部精液，留于清潔收集器皿內，標明采集時間，置37 ℃培養箱內，液化后進行精液常規分析。

　　1.4 精液分析 采用國產WLJY-9000偉力彩色精子質量檢測系統軟件配合載物臺溫控儀以及計算機操作，參照《WHO人類精液及精子-宮頸黏液相互作用實驗室檢驗手冊》[9]對精子密度、精子活力和精子活力分級進行分析。

　　1.5 精子DNA完整性檢測 采用吖啶橙實驗（acridine orange test, AOT）染色對精子DNA完整性檢測[10].將液化后精子進行精液分離，1 500 r/min離心10 min,去除精漿，以37 ℃ 0.01 mol/L PBS液洗滌沉淀3次，將精子制備為精子懸液，然后將精子懸液涂片，風干后以Carnoy液（3份甲醛與1份冰醋酸混合）固定過夜；固定后的精子涂片以吖啶橙染液染色5 min,蒸餾水洗片3次，風干后行熒光顯微鏡檢（放大400倍，激發波長為460 nm）。為了保證檢測結果的可靠性，染色后的精子涂片須立即觀察，防止熒光淬滅。經染色后，正常精子DNA呈雙鏈在激發光下呈綠色，而變性或受損的精子DNA則斷裂為單鏈呈黃色或紅色。在熒光顯微鏡光鏡同一視野下隨機計數200個精子，以異常精子所占的百分比來表示精子DNA受損程度。

　　1.6 統計學分析 采用SPSS13.0進行數據處理，計數資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗和χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

　　2 結 果2.1 研究對象基本情況 對研究對象基本資料進行統計，以平均每日吸煙超過10支、連續吸煙6個月及以上為吸煙，以平均每日飲酒量50 mL（純乙醇量），連續6個月及以上為飲酒。兩組患者在年齡、飲酒史、吸煙史等方面無統計學差異（P>0.05,表1）。 表1 研究對象的基本狀況2.2 精子活力檢測結果 反復自然流產組和正常生育對照組精子密度及活力檢測結果見表2.

　　2.3 精子DNA完整性檢測結果 反復自然流產組和正常生育對照組精子DNA受損程度分別為（75.4±7.5）%和（30.2±5.8）%,兩組間差異有統計學意義（P<0.05）。表2 反復自然流產組和正常生育對照組精子密度及活力3 討 論反復自然流產是婦產科常見病。近年來的研究表明其可能與解剖異常、免疫失調、內分泌紊亂、染色體異常、感染及基因多態性等有關，但是其確切病因尚不清楚。

　　常規的精液分析能夠從精子密度、精子活力和精子形態等方面反映精液質量，但是其在精子功能的評價方面價值有限，不能直接反映精子受精能力和對胚胎發育的影響。近年來的研究表明精子DNA的完整性與精子活力、精子形態及精子功能有顯著相關性，并且可以影響受精卵的分裂以及胚胎的發育[5-7].精子DNA是遺傳信息的載體，精子DNA的完整性對種族的繁衍具有重要意義，但是精子生成過程中染色質的濃縮異常、受損精原細胞的凋亡異常、環境毒物以及不良的生活習慣都會造成精子DNA損傷。

　　吖啶橙是一種熒光絡黃染料，具有高度的異染性，吖啶橙以插入的方式與雙螺旋的DNA分子結合；在激發波照射情況下，當與雙鏈DNA結合時呈單體形式發出綠色熒光，與單鏈DNA結合時呈聚合物形式發出紅色或黃色熒光[11].而精子DNA損傷的特征性改變為精子DNA單鏈形成和雙鏈斷裂[12],所以吖啶橙實驗被用來檢測精子DNA損傷。精子經吖啶橙染色后，可以采用熒光顯微鏡檢或流式細胞儀對染色結果進行判定，由于熒光顯微鏡檢操作簡單和經濟而被廣泛使用[13].

　　本研究為了探討精子DNA完整性在反復自然流產中的可能作用，對反復自然流產患者丈夫和正常生育對照男性精子DNA完整性進行了檢測，并對研究對象精液進行了常規分析。研究結果表明反復自然流產組精子DNA完整性顯著低于正常對照組，而且反復自然流產組精子密度和精子活力也顯著低于正常對照組，但是精子DNA完整性受損是否是導致精子密度和精子活力下降的原因尚不清楚。

　　綜上所述，精子DNA完整性與反復流產有顯著的相關性，并且反復自然流產患者丈夫精液常規存在異常。然而，精子DNA完整性損傷導致反復流產的致病機理尚需進一步研究。

　　參考來源：《反復自然流產與精子DNA完整性的相關性研究》吳大鵬，吳齊飛，李旭東，《現代泌尿外科雜志 》2008年第12卷第2期

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