豚鼠銀屑病樣動物模型中角蛋白K14，16，17表達水平的變化

　　銀屑病的發(fā)病機制極其復(fù)雜，其組織病理學(xué)的改變主要表現(xiàn)為角質(zhì)形成細胞過度增殖、炎癥細胞聚集和真皮乳頭部血管擴張三大特征.其中，角質(zhì)形成細胞過度增殖常常伴有異常的角化過程，同時出現(xiàn)角蛋白表達的改變.為了能夠更好地研究銀屑病的發(fā)病機制，合適而科學(xué)的動物模型顯得極為重要.我們從分子水平研究心得安外涂所致豚鼠銀屑病樣動物模型的可行性.

　　目的：研究心得安外涂所致豚鼠銀屑病樣動物模型皮損中角蛋白K14，16，17表達水平的變化，從分子水平研究此種動物模型的可行性.

　　方法：用50g L-1 心得安乳劑外涂豚鼠耳背部皮膚誘導(dǎo)銀屑病樣動物模型，應(yīng)用原位雜交法檢測銀屑病樣皮損中角蛋白K14，16，17的表達.

　　結(jié)果：心得安外涂所致豚鼠銀屑病樣動物模型皮損中角蛋白K14，16表達水平較正常對照組明顯增高，K17的水平無明顯變化.

　　結(jié)論：心得安外涂所致豚鼠銀屑病樣動物模型不僅在組織病理學(xué)而且在分子水平上與人類銀屑病皮損基本一致.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　30只健康成年豚鼠（體質(zhì)量300～400g，雌雄不拘）由本校實驗動物中心提供.50g L-1 心得安乳劑由西京醫(yī)院藥劑科配制.自行設(shè)計角蛋白K14，16，17探針，由北京奧科公司合成，原位雜交試劑盒購自博士德公司.

　　1.2 方法

　　①模型制備:實驗動物隨機分為兩組，實驗組20只，應(yīng)用50g L-1 心得安乳劑均勻外涂雙耳背皮膚，每日3次，連續(xù)涂4wk.對照組10只用單純?nèi)閯┩磕?4wk后取雙耳背部皮膚，一只耳用100mL L-1 甲醛溶液固定，另一只耳置于干燥瓶中，存放于-80℃低溫冰箱保存.②HE染色:將用100mL L-1 甲醛溶液固定的標本脫水，透明浸蠟后包埋，制作石蠟切片，常規(guī)HE染色.在光鏡下逐一觀察組織學(xué)所見.③原位雜交:置于干燥瓶中的組織經(jīng)常規(guī)脫水、浸蠟包埋后切片，厚度6μm，展開在經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，切片經(jīng)常規(guī)脫蠟脫水，30mL L-1 H 2 O2 室溫處理10min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗5min×3次.滴加胃蛋白酶工作液，37℃消化10min，充分暴露mRNA，0.5mol L-1 PBS洗5min×3次，蒸餾水洗1次.每張切片上加20μL含標記探針的原位雜交液，蓋上專用蓋玻片，置濕盒中37℃雜交過夜.同時設(shè)不加探針的空白對照.分別用30℃的2×SSC和0.2×SSC各洗滌5min×3次.滴加封閉液，室溫20min.滴加兔抗地高辛，37℃孵育1h，0.5mol L-1 PBS洗2min×3次.滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育30min，0.5mol L-1 PBS洗2min×3次.滴加SABC，7℃孵育30min，0.5mol L-1 PBS洗5min×4次.DAB顯色，蘇木素復(fù)染，充分水洗，然后乙醇脫水，二甲苯透明，封片.

　　2 結(jié)果

　　2.1 HE染色結(jié)果

　　正常對照組豚鼠皮膚可見菲薄的角質(zhì)層，顆粒層約為1～3層，棘細胞層約3～5層，基底層為單層柱狀細胞.真表皮交界較平，真皮內(nèi)有散在少數(shù)單核細胞浸潤（Fig1）.實驗組全部標本共40份均可見到不同程度的棘層肥厚、表皮突延伸呈棒狀、真皮乳頭上伸杵狀變及毛細血管擴張，36份標本可見廣泛或局灶性的角化不全，顆粒層變薄或消失（Fig2）.我們參考通用的Baker評分方法，對每份標本逐一進行組織學(xué)評分分析.應(yīng)用組織評分法（典型的銀屑病皮損評分在4.0～10.0之間）評分得到，40份涂藥組標本組織學(xué)評分為7.6±0.6，20份正常對照組組織學(xué)評分為0.8±0.1，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果差異顯著（P<0.01）.

　　2.2 原位雜交結(jié)果

　　對正常豚鼠耳背部皮膚和銀屑病動物模型皮損處組織的K14，16，17原位雜交結(jié)果顯示，正常皮膚中，在基底層細胞中見到K14的陽性雜交信號，表現(xiàn)為細胞漿中出現(xiàn)棕黃色細小或粗大顆粒，但信號較弱，而K16和K17則未見到陽性信號.在銀屑病樣皮損中，基底層及棘細胞層均有K14的高表達，在棘細胞層K16高表達;而K17僅為低表達（Fig3～6）.根據(jù)圖象掃描后的處理結(jié)果顯示，銀屑病模型動物皮損處角蛋白K14及K16的表達較對照組顯著升高（K14P<0.05，K16P<0.01），而K17的表達則無顯著性差異.

　　圖1 正常對照組HE染色(略)

　　Fig1 HE staining of normal control group ×200

　　圖2 實驗組HE染色(略)

　　Fig2 HE staining of treated group ×200

　　圖3 正常對照組角蛋白K14原位雜交(略)

　　Fig3 Keratin14hybridization in situ of normal control group ×200

　　圖4 實驗組角蛋白K14原位雜交(略)

　　Fig4 Keratin14hybridization in situ of treated group ×200

　　圖5 正常對照組角蛋白K16原位雜交(略)

　　Fig5 Keratin16hybridization in situ of normal control group ×200

　　圖6 實驗組角蛋白K16原位雜交(略)

　　Fig6 Keratin16hybridization in situ of treated group ×200

　　3 討論

　　銀屑病是一種具有多基因遺傳特性的疾病，其發(fā)病機制極其復(fù)雜，至今尚未完全明了.其中研究報道它與感染、內(nèi)分泌機能障礙、免疫功能紊亂、酶的改變及遺傳因素有關(guān).銀屑病的組織病理學(xué)主要表現(xiàn)為角質(zhì)形成細胞過度增生、炎癥細胞聚集和真皮乳頭部血管增生擴張三大特征，從而出現(xiàn)角化過度、角化不全、顆粒層消失、棘細胞層增厚、表皮突延伸呈棒狀、真皮乳頭上伸呈杵狀改變.為了能夠更好的研究其發(fā)病機制，曾經(jīng)有學(xué)者設(shè)計了多種動物模型，其中心得安外涂所致豚鼠耳背部皮膚銀屑病樣皮損的方法由于簡便易行，目前已廣泛地應(yīng)用于制備銀屑病動物模型.

　　本實驗中我們以50g L-1 的心得安乳劑外涂于豚鼠耳背部皮膚，不但重復(fù)了Gaylarde等［1，2］ 以心得安涂藥在豚鼠側(cè)背部皮膚造成的角化過度，角化不全和棘層肥厚諸改變;還見到了廣泛或灶狀的顆粒層消失及表皮突延長呈棒狀和真皮乳頭上伸呈杵狀改變，這些特點更加接近人類銀屑病的組織病理學(xué)改變.由此可見，心得安外涂在豚鼠皮膚引起銀屑病樣皮損從組織病理學(xué)上觀察具有可行性和較高的可重復(fù)性.

　　在銀屑病的組織病理學(xué)改變中，角質(zhì)形成細胞的過度增殖是主要的特征.過度增殖的角質(zhì)形成細胞同時出現(xiàn)了異常的角蛋白表達.早在1960年Roth-berg就發(fā)現(xiàn)銀屑病患者與正常人相比表皮角蛋白就有差異，目前較為一致的看法主要是集中在K5/K14，K1/K10，K6/K16和K17的變化.在正常表皮內(nèi)，K5/K14的轉(zhuǎn)錄主要在基底層，而基底上層基本沒有，其蛋白的表達主要位于基底層并隨后呈現(xiàn)明顯的下降趨勢［3］ .Holland等［4］ 和Thewes等［5］ 發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損內(nèi)K5和K14的水平同正常表皮相比發(fā)生了變化，K5明顯降低而K14卻顯著增高.K1和K10在正常表皮只是在基底上層大量表達，被認為是表皮正常表達的標志［6］ .銀屑病皮損處K1和K10的表達較正常表皮明顯減少，取而代之的是角蛋白K6和K16的表達.K16是過度增生的表皮的特征，同時它在銀屑病活動性皮損邊緣處也有表達，被認為是基底層以上細胞的一種早期變化［7-9］ .Thewes等進一步證實臨床上銀屑病患者尚未受累的皮膚也有K6和K16的表達，該發(fā)現(xiàn)可以很好的解釋Kobner現(xiàn)象，認為K16可以作為檢測銀屑病的有效標志;K17在正常人表皮不表達，而在銀屑病患者的皮損處出現(xiàn)高表達，被認為是銀屑病相關(guān)性角蛋白［10，11］ .同時，最近的研究發(fā)現(xiàn)天然抗角蛋白自身抗體（AK auto Abs）在銀屑病發(fā)病及治療過程中起著重要的作用［12，13］ .

　　我們的實驗結(jié)果顯示:應(yīng)用原位雜交的方法檢測心得安所致的豚鼠銀屑病樣皮損中角蛋白K14，K16mRNA的表達水平，結(jié)果實驗組較正常對照組均明顯增高（P<0.05，P<0.01），得到了與人類銀屑病皮損一致的結(jié)果，從而在分子水平上進一步證明了心得安外涂所致銀屑病樣皮損的豚鼠動物模型的可行性.但角蛋白K17則和正常對照組無明顯的差異，這說明了此種動物模型只是在一些方面較好的模擬了人類銀屑病的發(fā)病機制，但由于人類銀屑病發(fā)病機制的復(fù)雜性，在沒有準確地找到其致病基因的前提下，所有的動物模型都會有其局限性.

　　參考來源：《第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報》2001年12月22卷24期；《豚鼠銀屑病樣動物模型中角蛋白K14，16，17表達水平的變化》；樊平申，廖文俊，劉玉峰

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