腫瘤壞死因子與γ-干擾素抗膀胱腫瘤協同作用的實驗研

　　研究重組人腫瘤壞死因子(rHTNF)與γ-干擾素(IFN-γ)協同抗膀胱腫瘤的作用機理，探索治療膀胱腫瘤的新方法。

　　材料與方法　人膀胱腫瘤細胞株BIU-87由北京醫科大學泌尿外科研究所提供。(1)用MTT法[1]測定rHTNF或IFN-γ，以及在單獨應用和聯合應用時，在不同藥物濃度及不同作用時間內對BIU-87細胞的最大殺傷率。酶標儀測定吸光度A值。殺傷率(%)=(對照孔A值-實驗孔A值)/對照孔A值×100%。(2)對經過IFN-γ(0.15μg/ml)作用6小時與未經IFN-γ作用的對照組BIU-87細胞，分別行放射配體結合時間、解離和特異性競爭試驗，通過Scatchard圖計算受體數目及親和力，進行rHTNF受體分析，觀察IFN-γ對TNF受體的影響。(3)IFN-γ對rHTNF內化率和降解率的影響：經IFN-γ作用6小時和未經IFN-γ作用的BIU-87細胞分別與125I-rHTNF于37℃反應3小時后，離心沉淀細胞。將細胞懸浮于0.1mmol/L、pH 3.0的甘酸-鹽酸緩沖液中，洗掉結合在細胞膜上的125I-TNF，測定細胞內剩余的放射性，作為內化量。50%的三氯醋酸可溶解125I-rHTNF降解產物，同時沉淀未降解的125I-rHTNF，溶液中的放射性即代表125I-rHTNF的降解量。然后計算細胞內125I-rHTNF與細胞最大結合125I-rHTNF的比值作為內化率;50%三氯醋酸溶液中的放射性與內化放射性的比值即為降解率。

　　結　果　(1)rHTNF和IFN-γ單獨應用時對BIU-87細胞的最大殺傷率分別為61%和15%，兩者聯合應用時對BIU-87細胞的最大殺傷率達89%，明顯高于rHTNF單獨應用時對BIU-87細胞的最大殺傷率(P<0.05)。(2)125 I-rHTNF與BIU-87細胞于37℃反應3小時可達平衡狀態。解離曲線表明該反應呈可逆性。非標記的rHTNF可競爭性抑制125 I-rHTNF與BIU-87細胞的結合。IFN-γ對該結合試驗無抑制作用。IFN-γ使BIU-87細胞表面受體數量由0.41×10-11nmol/細胞增加至0.92×10-11nmol/細胞，對受體的親和力無顯著影響。(3)IFN-γ可顯著提高BIU-87細胞對125I-rHTNF的內化和降解的絕對量，但對內化率和降解率無顯著影響。

　　討　論　TNF由激活的單核巨噬細胞和活化的T淋巴細胞及部分腫瘤細胞分泌，具有多種生物活性，是迄今發現的抗腫瘤活性最強的細胞因子，其可能成為有一定臨床應用價值的抗癌生物制劑。不同類型腫瘤細胞顯示對TNF不同的反應：細胞毒性、生長抑制及無作用;甚至同一種類型細胞的不同細胞株對TNF作用亦表現出不同的反應。一般認為耐受TNF的腫瘤細胞能產生小劑量的內源性TNF，內源性TNF通過誘導保護性蛋白的產生，減弱TNF對腫瘤細胞的毒性[2]。本研究結果表明，rHTNF對膀胱腫瘤細胞株BIU-87的最大殺傷率為61%。IFN-γ和TNF對許多腫瘤細胞的生長抑制有協同作用，作用機制尚不清楚。本試驗發現IFN-γ和rHTNF對BIU-87細胞的殺傷亦有協同作用，其最大殺傷率可達89%。其協同作用可能部分與INF-γ增加BIU-87細胞表面的rHTNF受體表達有關。

　　TNF嚴重的毒副作用限制了臨床應用。目前已經有幾種TNF衍生物研制成功。本研究提示：TNF局部用藥是合理的，同時選擇毒副作用較輕的TNF衍生物與IFN-γ等與其協同抗腫瘤作用的細胞因子應用，可在一定程度上減輕TNF的毒副反應。

　　參考文獻

　　[1]　Sargent J,Eigie R,Taylor CG,et al. The identification of drug resistance in ovarian cancer and breast cancer:application of the MTT assay. Contrib Gynecol Obstet,1994,19∶64-67.

　　[2]　Mutch DG,Powell CB, Lee CY，et al.Resistance to cytolysis by TNF in malignant gynecological lines is associated with the expression of protein that prevent the activation of phospholipase A2 by TNF.Cancer Res,1992,52∶866-72.