高脂血癥對(duì)實(shí)驗(yàn)性腎病大鼠腎臟TGF-β1 基因表達(dá)的影響

　　動(dòng)物模型中，高脂飲食在一定的觀察期后能形成類似人FSGS病變。腎病大鼠給予高脂飲食后，腎小球硬化明顯加重，并加速進(jìn)展至CRF ［1］ 。近年來(lái)，大量的研究顯示多種細(xì)胞因子參與腎病進(jìn)程，其中起主要作用的是TGF-β 1［2］ 。TGF-β 1 廣泛分布于血小板，巨噬細(xì)胞及腎臟組織，能通過(guò)增加ECM蛋白的合成，抑制其降解及調(diào)節(jié)細(xì)胞-整合素受體促進(jìn)ECM的積聚，并吸引單核細(xì)胞和刺激成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成纖維細(xì)胞，促進(jìn)腎臟硬化 ［3］ 。目前認(rèn)為，TGF-β 1 在腎組織中持續(xù)過(guò)度表達(dá)是引起腎小球硬化的重要原因 ［4］ 。我們用RT-PCR和原位雜交觀察高脂飲食ADR腎病大鼠腎臟的TGF-β 1 的基因表達(dá)及在腎小球，腎小管間質(zhì)的分布，并分別觀察辛伐他汀和苯那普利對(duì)高脂飲食腎病大鼠腎臟TGF-β 1 的基因表達(dá)的影響，及高脂飲食正常大鼠12周時(shí)TGF-β 1 基因表達(dá)。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 雄性SD大鼠60只（由上海醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房提供），體重（190±10）g，ADR制成腎病模型，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為腎病+高脂飼料組（AH），腎病+高脂飼料+辛伐他汀組（AHS），腎病+高脂飼料+苯那普利組（AHB），高脂飼料組（HC），普通飼料+阿霉素組（AC）及正常對(duì)照組（C），每組10只。根據(jù)大鼠TGF-β 1 cDNA的序列，設(shè)計(jì)TGF-β 1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）的引物，以RT-PCR法觀察不同組大鼠腎臟TGF-β 1 mRNA在4，8，12周時(shí)的表達(dá)，并以GAPDH為內(nèi)參照在紫外光激發(fā)下，用樂(lè) 凱黑白膠片拍照，用T90型圖像處理系統(tǒng)對(duì)膠片進(jìn)行分析。采用固有RNA法進(jìn)行RT-PCR的半定量分析。用GAPDH mRNA作為內(nèi)參照，檢測(cè)不同處理方法對(duì)大鼠腎臟TGF-β 1 mRNA水平的影響。用相同的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR，使其控制在指數(shù)期，用GAPDH產(chǎn)物的光密度值校正TGF-β 1 產(chǎn)物的光密度值，然后用校正值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。標(biāo)記（地高辛）TGF-β 1 探針，在不同組大鼠的腎組織冰凍切片上作原位雜交，檢測(cè)12周時(shí)大鼠腎臟TGF-β 1 mRNA的表達(dá)情況。

　　1.2 試劑 總RNA提取試劑盒購(gòu)自Promega公司;TGF-β 1 原位雜交試劑盒購(gòu)自Boehringer Mannheim公司。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用EPI5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各指標(biāo)均用ˉx±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。 2 結(jié)果 見表1，圖1。（略）

　　表1 各組大鼠腎臟RT-PCR檢測(cè)TGF-β 1 產(chǎn)物mRNA的cDNA水平變化（略）

　　注:各組大鼠腎臟RT-PCR檢測(cè)TGF-β 1 產(chǎn)物mRNA的cDNA水平4，8，12周與4周比較a:P>0.05，b:P<0.05;各組大鼠腎臟RT-PCR檢測(cè)TGF-β 1 產(chǎn)物mRNA的cDNA水平8，12周與AH組比較:c:P<0.05與AC組相比均明顯升高，半定量分析也表明AH組腎臟TGF-β 1 產(chǎn)物mRNA的cDNA由4w至8w上升明顯，而由8w至12w升高幅度減緩;AHS組8w，12w時(shí)較AH組有明顯差別，與AC組差異不顯著;AHB組腎臟TGF-β 1 產(chǎn)物mRNA的cDNA8w，12w時(shí)較AHS組略低，無(wú)顯著差異;但其8w，12w腎臟TGF-β 1 產(chǎn)物mRNA的cDNA水平略高于HC組。HC組腎臟TGF-β 1 產(chǎn)物mRNA的cDNA8w，12w時(shí)較C組相比無(wú)顯著差異。

　　原位雜交結(jié)果顯示:AH組大鼠在12w時(shí)可見腎小管細(xì)胞有藍(lán)褐色陽(yáng)性細(xì)胞，彌漫，腎小球染色略淺，表明TGF-β 1 mRNA在本組大鼠中信號(hào)已明顯增強(qiáng)，且彌漫性分布;AC組大鼠在12w時(shí)可見腎小管間質(zhì)細(xì)胞有藍(lán)褐色陽(yáng)性信號(hào)，局灶，腎小球染色淺，表明TGF-β 1 mRNA表達(dá)比高脂飲食腎病大鼠局限;AHS組大鼠12w時(shí)TGF-β 1 mRNA陽(yáng)性細(xì)胞在小管中明顯，分布散在，信號(hào)較弱;AHB大鼠在12w時(shí)TGF-β 1 mRNA陽(yáng)性細(xì)胞在小管中弱，低于AHS組;HC組12w時(shí)TGF-β 1 mRNA陽(yáng)性信號(hào)細(xì)胞在小管中弱，少量散在分布，腎小球無(wú)陽(yáng)性信號(hào);C組大鼠12w時(shí)腎小球及腎小管均未見陽(yáng)性信號(hào)細(xì)胞。

　　3 討論

　　在不同的大鼠腎臟病變模型中，人們觀察到高脂血癥在加重腎臟病變的同時(shí)，可伴隨腎臟TGF-β 1 mRNA的表達(dá)增高，并發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與腎臟的病變程度密切相關(guān) ［5］ ，表明高脂血癥至少部分通過(guò)TGF-β 1 引起腎臟損害。

　　現(xiàn)有的研究表明TGF-β 1 是一促纖維化生長(zhǎng)因子，既有促進(jìn)組織細(xì)胞增殖的特性，又有促進(jìn)纖維化的作用，其能促進(jìn)許多器官的纖維化。TGF-β 1 可明顯增加培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞的數(shù)量 ［6］ ，還直接刺激基質(zhì)分子如FN，膠原和蛋白聚糖的合成，抑制蛋白酶的分泌及誘導(dǎo)蛋白酶抑制劑的產(chǎn)生以阻止基質(zhì)的降解 ［7］ 。TGF-β 1 可通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)組織纖維化，除促進(jìn)腎小球硬化和腎小管上皮細(xì)胞凋亡外，還通過(guò)自分泌及旁分泌機(jī)制使間質(zhì)成纖維細(xì)胞分化為纖維細(xì)胞，最終導(dǎo)致間質(zhì)纖維化 ［8］ 。本研究采用兩種方法觀察高脂飲食ADR腎病大鼠腎臟的TGF-β 1 mRNA表達(dá)，用半定量RT-PCR法發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)腎組織TGF-β 1 mRNA在8，12w時(shí)均高于普通飼料腎病大鼠，與其腎臟形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果相一致。原位雜交也顯示12w時(shí)高脂飲食ADR腎病組腎臟TGF-β 1 mRNA在腎小球及小管間質(zhì)均呈陽(yáng)性信號(hào)，呈彌漫分布，小管間質(zhì)信號(hào)強(qiáng)，而普通飼料腎病組腎小球內(nèi)陽(yáng)性信號(hào)弱，小管間質(zhì)僅呈局灶性變化，表明高脂飲食明顯增強(qiáng)腎病大鼠腎臟TGF-β 1 mRNA的表達(dá)，分布以小管間質(zhì)為主。而腎臟TGF-β 1 mRNA的高表達(dá)可明顯加重腎臟的纖維化病變，因此認(rèn)為高脂血癥可能通過(guò)TGF-β 1 的作用促進(jìn)腎病的進(jìn)程。

　　實(shí)驗(yàn)觀察到辛伐他汀對(duì)高脂飲食腎病大鼠腎臟TGF-β 1 mRNA表達(dá)的影響表現(xiàn)在治療組大鼠腎臟腎小球及小管間質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性信號(hào)均較未治療組明顯減弱，且小管中陽(yáng)性細(xì)胞呈局灶性分布，表明辛伐他汀在控制高脂血癥的同時(shí)，不僅減輕腎小球和小管病變，還明顯降低腎臟TGF-β 1 mRNA的表達(dá)強(qiáng)度，從而延緩腎臟的纖維化。但辛伐他汀如何降低TGF-β 1 mRNA在腎臟表達(dá)的確切機(jī)制不甚明了。有研究表明高脂血癥時(shí)可出現(xiàn)RAS活性增高 ［9］ ，因此，我們認(rèn)為辛伐他汀降低腎病大鼠腎臟TGF-β 1 的基因表達(dá)可能與其降低高脂血癥而間接地抑制腎素-血管緊張素-TGF-β 1 軸的作用有關(guān)。

　　ACEI被證明能顯著減輕或延緩腎臟的纖維化，作用機(jī)制與降低腎小球內(nèi)壓，抑制系膜細(xì)胞的擴(kuò)張及抑制AngⅡ引起的TGF-β 1 高表達(dá)有關(guān)。本研究用苯那普利治療高脂飲食ADR腎病大鼠，觀察到腎臟TGF-β 1 mRNA的表達(dá)明顯減弱，腎小球內(nèi)陽(yáng)性信號(hào)微弱，小管間質(zhì)細(xì)胞中僅見少量的陽(yáng)性信號(hào)，較辛伐他汀組大鼠的腎臟TGF-β 1 mRNA的表達(dá)低，表明抑制AngⅡ可明顯降低腎病大鼠腎臟的TGF-β 1 mRNA的表達(dá)。AngⅡ可刺激腎間質(zhì)細(xì)胞增殖及增加ECM的積聚，引起小管間質(zhì)損害 ［10］ 。另外，通過(guò)內(nèi)分泌，旁分泌及自分泌增加的TGF-β 1 還引起小管間質(zhì)ECM的積聚和纖維化。因此，在高脂飲食ADR腎病大鼠模型中，用苯那普利治療可減輕腎小球及小管間質(zhì)病變，并下調(diào)腎臟TGF-β 1 mRNA的表達(dá)，進(jìn)一步支持在慢性腎病過(guò)程中，抑制腎素-血管緊張素-TGF-β 1 對(duì)保護(hù)腎功能，延緩腎臟的硬化有重要意義。

　　單純高脂飲食可引起大鼠腎臟FSGS的變化，本研究中單純高脂飲食僅觀察12w是為區(qū)別腎病模型組與正常型的差異。RT-PCR法12w時(shí)腎臟TGF-β 1 mRNA表達(dá)較正常增高，原位雜交中腎小球無(wú)陽(yáng)性信號(hào)，腎小管僅見少量散在的陽(yáng)性信號(hào)。結(jié)果表明高脂血癥正常大鼠12w時(shí)，盡管腎臟損傷輕微，但已有腎臟TGF-β 1 基因表達(dá)的增高，也就解釋腎臟疾病一旦發(fā)生，如不干預(yù)，則往往進(jìn)行性發(fā)展的原因。（參考來(lái)源：高脂血癥對(duì)實(shí)驗(yàn)性腎病大鼠腎臟TGF-β1 基因表達(dá)的影響，劉育軍，中華醫(yī)學(xué)研究雜志2005年第5卷第9期）

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