動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中冠狀動(dòng)脈內(nèi)源性一氧化碳及血紅素氧化酶-1的變化

　　近年的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性一氧化碳（CO）是一種新型的信使分子。作為內(nèi)源性一氧化碳合成的限速酶和關(guān)鍵酶，即血紅素氧化酶（Heme Oxygenase，HO）已被證實(shí)幾乎分布于所有器官和組織 ［1］ ，HO-1和CO在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制中的作用，目前罕見報(bào)告。本研究采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、分子原位雜交、免疫組織化學(xué)染色等多項(xiàng)指標(biāo)，從不同側(cè)面研究CO及其合成酶HO-1在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中的作用機(jī)制，旨在為動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理及防治探索一條新的途徑。

　　1 材料和方法

　　1.1 動(dòng)脈粥樣硬化的動(dòng)物模型制備及分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:新西蘭大白兔，雄性，120只，體重0.5～1.1kg，實(shí)驗(yàn)總時(shí)間為12周，由本校動(dòng)物所提供。采用隨機(jī)法分為5組（對(duì)照組及四個(gè)實(shí)驗(yàn)組），每組24只，分籠飼養(yǎng)。對(duì)照組食用基礎(chǔ)飼料，而實(shí)驗(yàn)組添加膽固醇粉1g/天/只，于傍晚給藥。于喂養(yǎng)的第2、4、8、12周分別將各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的兔頸動(dòng)脈放血處死。

　　1.2 HO-1免疫組化染色（SP法） 將心肌及冠狀動(dòng)脈進(jìn)行石蠟包埋、切片厚度為6μm。HO-1單抗的稀釋度為1/250，其余按常規(guī)步驟進(jìn)行。用PBS代替抗體作為陰性對(duì)照。陽(yáng)性為棕黃色。

　　1.3 HO-1mRNA的原位雜交 pRHO1（HO-1）cDNA質(zhì)粒由日本Toshisuke教授惠贈(zèng)。經(jīng)過轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增、抽提與純化、酶切鑒定后，用寶靈曼的地高辛標(biāo)記檢測(cè)試劑盒進(jìn)行標(biāo)記。將心肌及其冠狀動(dòng)脈的石蠟標(biāo)本切片，厚度為6μm。按常規(guī)步驟進(jìn)行。陰性對(duì)照:（1）雜交前用RNase100μg/ml37℃1h預(yù)處理組織（消化mRNA）切片。（2）用未標(biāo)記的pRHO1cDNA探針進(jìn)行雜交反應(yīng)。

　　1.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定冠狀動(dòng)脈HO-1mRNA表達(dá) 總RNA提取采用異硫氰酸胍一步法。采用顯微分離法分離冠狀動(dòng)脈，利用Promega提供的試劑進(jìn)行提取冠狀動(dòng)脈總RNA。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):采用隨機(jī)引物法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增HO-1和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）特異性片段。擴(kuò)增HO-1cDNA特異性片段的引物是根據(jù)Toshisuke發(fā)表的鼠HO-1特異性引物的序列確定的。上游引物為5′-GAATTCAGCATGCCCCAGGTGGT-3′，下游引物為5′-TCTAGACTAGCTGGATGTTGAGCAGGA-3′。在進(jìn)行RT-PCR的同時(shí)擴(kuò)增鼠β-actin用作內(nèi)參照，保證每次實(shí)驗(yàn)的相對(duì)可比性，擴(kuò)增鼠β-actin特異性片段的上游引物為5′-GCG GGA AAT CGT GCT ACA TT-3′，下游引物為5′-GAT GGA GTT GAA GGT AGT TTC GTG-3′。94℃1min，50℃1min，72℃1min。首輪循環(huán)95℃2min，最后72℃延伸5min，共進(jìn)行30次循環(huán)。然后進(jìn)行1%瓊脂糖電泳分析。

　　1.5 HO活性測(cè)定 冠狀動(dòng)脈分離后，按文獻(xiàn)方法 ［2］ 測(cè)定HO活性。根據(jù)在464nm和530nm處的光吸收推算出，膽紅素的消光系數(shù)為401/mmol/Lcm。 蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法。

　　1.6 CO含量測(cè)定 按文獻(xiàn)方法 ［3］ 測(cè)定CO活性。

　　1.7 放免法測(cè)定冠狀動(dòng)脈cGMP含量 按 125 I標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

　　1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Microsoft Excel97數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行單因素方差分析及部分指標(biāo)相關(guān)分析。

　　2 結(jié)果

　　2.1 冠狀動(dòng)脈HO-1mRNA的表達(dá) 原位雜交法檢測(cè)顯示在正常情況下冠狀動(dòng)脈HO-1mRNA表達(dá)較少，隨著實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，在實(shí)驗(yàn)組第2周（圖1），12周（圖2）內(nèi)皮細(xì)胞HO-1mRNA的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，陰性對(duì)照組中冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞呈陰性反應(yīng)。

　　2.2 冠狀動(dòng)脈HO-1免疫組織化學(xué)染色的變化 對(duì)照組冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞在HO-1呈弱陽(yáng)性反應(yīng)、第二周實(shí)驗(yàn)組中冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的HO-1呈局灶性弱陽(yáng)性反應(yīng)，但在心肌間質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮及心肌細(xì)胞索周膜內(nèi)呈陽(yáng)性;第四周實(shí)驗(yàn)組的冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)HO-1呈弱陽(yáng)性反應(yīng)，冠狀動(dòng)脈分支內(nèi)皮細(xì)胞呈陽(yáng)性或弱陽(yáng)性反應(yīng);部分心肌細(xì)胞呈片狀陽(yáng)性反應(yīng);第八周實(shí)驗(yàn)組中冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞、心肌小血管及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞索周膜的HO-1呈陽(yáng)性反應(yīng);第十二周實(shí)驗(yàn)組中冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的HO-1呈強(qiáng)陽(yáng)性（圖3），而心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞也呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)。陰性對(duì)照:冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞HO-1呈陰性。

　　2.3 冠狀動(dòng)脈HO-1mRNA表達(dá)圖像分析、HO活力（pmol/mg.pr/h）、CO（μg/mg）及cGMP（pmol/L）濃度變化 見表1。 表1 冠狀動(dòng)脈血紅素氧化酶-1mRNA表達(dá)圖像分析、血紅素氧化酶活力（pmoL/mg.pr/h）、內(nèi)源性一氧化碳（μg/mg）及鳥苷酸環(huán)化酶（pmol/L）濃度變化 （略）

　　注:與前一時(shí)相點(diǎn)相比: a P<0.01

　　RT-PCR檢測(cè)到，第二周時(shí)HO-1mRNA的表達(dá)開始增加，隨著動(dòng)脈粥樣硬化的逐漸進(jìn)展，mRNA的表達(dá)量逐漸增加，第12周時(shí)mRNA的表達(dá)仍較高。β-actin的表達(dá)在各時(shí)相點(diǎn)之間表達(dá)量無(wú)明顯變化（圖4略）。從表可見隨著動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展冠 狀動(dòng)脈HO的活性、CO含量及cGMP也逐漸增高，并且每一時(shí)相點(diǎn)與前一時(shí)相點(diǎn)相比呈非常顯著性增加（P均<0.01）。相關(guān)分析表明內(nèi)源性一氧化碳的含量和cGMP的濃度呈非常明顯的正相關(guān)（r=0.99259，P<0.01）。

　　3 討論

　　心血管疾病死亡率在我國(guó)疾病死亡率居第一或第二位，其中冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)病率與死亡率在逐年上升。盡管150年來(lái)，關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制已提出許多學(xué)說(shuō)，但很多問題仍不清楚。目前國(guó)外研究表明CO在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能和細(xì)胞相互作用方面起著重要的作用。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明在腦中CO是一種新型的神經(jīng)信使，而HO-1的可被誘生的性質(zhì)使其不僅在機(jī)體正常生理狀態(tài)下，而更主要在機(jī)體的病理狀態(tài)或應(yīng)激狀態(tài)下亦發(fā)揮作用 ［4］ 。HO-1和CO在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的作用，目前罕見報(bào)道。我們通過免疫組化染色和原位雜交研究發(fā)現(xiàn)HO-1主要存在于冠狀動(dòng)脈和主動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞層 ［5，6］ ，并隨著主動(dòng)脈壁和冠狀動(dòng)脈的內(nèi)皮和內(nèi)皮下動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病變逐漸加重，HO-1mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)呈動(dòng)態(tài)進(jìn)行性增強(qiáng)的趨勢(shì)。1998年5月Wang應(yīng)用原位雜交在人和動(dòng)物中研究了HO-1在主動(dòng)脈粥樣硬化損傷部位的分布狀態(tài)，也發(fā)現(xiàn)HO-1mRNA主要分布于內(nèi)皮細(xì)胞層和損傷部位增厚內(nèi)膜的泡沫細(xì)胞/巨噬細(xì)胞 ［7］ 。這與我們?cè)谥鲃?dòng)脈和冠狀動(dòng)脈上所進(jìn)行原位雜交的結(jié)果是一致的 ［5，6］ 。我們從RT-PCR結(jié)果也觀察到隨著動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展冠狀動(dòng)脈HO-1mRNA的表達(dá)強(qiáng)度逐漸增高。這與原位雜交所觀察到的結(jié)果是一致的。國(guó)外一些研究者在其他疾病的生理和病理過程中也觀察到HO-1在疾病的不同時(shí)期其基因和功能會(huì)有所改變。我們?cè)诠跔顒?dòng)脈HO-1的功能研究也發(fā)現(xiàn)，隨著動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展HO-1活性、CO的濃度和cGMP的含量逐漸增高。眾所周知內(nèi)皮素與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展有密切的關(guān)系。1995年Toshisuke報(bào)道證實(shí)cGMP增多抑制ET的產(chǎn) 生 ［8］ 。我們的研究和國(guó)外的研究均表明，CO含量增高導(dǎo)致cGMP增高。（參考文獻(xiàn)：動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病中冠狀動(dòng)脈內(nèi)源性一氧化碳及血紅素氧化酶-1的變化，張清華， 中華現(xiàn)代內(nèi)科學(xué)雜志2004年第1卷第1期 ）

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