氧化苦參堿對HBV轉基因鼠血清HBV DNA的抑制作用

　　越來越多的基礎和臨床研究發現氧化苦參堿有抗乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）作用，但其確切機制尚不明了[1-3]。HBV感染宿主有限，且體外培養困難，限制了HBV及其相關疾病的研究。自1985年以來，各種類型的HBV轉基因鼠相繼問世，從而為研究HBV及其相關疾病的發病機理和治療方法開辟了新途徑[4-5]。本文應用競爭PCR聯合產物酶聯雜交技術對HBV轉基因鼠血清中HBV DNA進行定量檢測，以便評價氧化苦參堿的抗HBV作用，為臨床應用提供重要的實驗依據。

材 料 和 方 法

1.1 HBV轉基因鼠模型的建立[6]
　　1.1.1 質粒 p1.0HBV由中國科學院生物化學研究所吳祥甫教授惠贈，3.2kb的adr型HBV全基因組DNA克隆在pUC18載體BamHI酶切位點上。
　　1.1.2 試驗用小鼠 購自揚州大學實驗動物室8周齡以上的性成熟ICR小鼠，飼養環境為清潔級動物房。
　　1.1.3 HBV轉基因鼠的制備 具體方法按文獻所述。

1.2 HBV轉基因鼠的整合鑒定[6] HBV轉基因鼠于4周齡剪尾0.1～0.5cm，以組織消化液[1M KCl，0.5M Tris-HCl pH8.3，0.1m MgCl2，0.45%NP40（v/v），0.45%Tween-20(v/v)，10g·L-1蛋白酶K]中，500C消化過夜，然后加等體積的飽和苯酚/氯仿抽提DNA，無水乙醇沉淀DNA，最后溶解在100uL無菌水中，PCR所用引物為I：5''-AGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTT-3''和II：5''-TACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3''，擴增片段位于HBcDNA區域，長度為470bp。PCR反應體系為5uL 10×緩沖液（0.5M KCl，0.1M Tris-HCl pH8.3，0.015M MgCl2，0.01%明膠），35uL無菌水，5uL 2mM dNTP, 引物I、II各2 uL。950C變性10min，加1uL Taq酶（2個單位），加50uL液體石蠟油密封，反應循環如下：930C變性60s，600C退火45s，720C延伸60s，35次循環，最后720C延伸增加10min。取1/10擴增產物進行電泳鑒定。

1.3 HBV轉基因鼠的表達鑒定 Amplicor HBV Monitor檢測試劑盒購自Roche Diagnostic Systems,Inc.，具體步驟按說明書推薦的方法進行。從HBV轉基因整合陽性的鼠取血，用后眼眶靜脈叢取血法收集血清，在標準品和標本中加入相同濃度的內對照，平行按上述方法處理血清，抽取HBV DNA后，行PCR。上游引物序列如下：5''-GTTGCCCGTTTGTCCTCTAC-3''，下游引物5''端以生物素標記，序列如下：5''-Biotin-GATGATGTGGTATTGGGGGC-3''。PCR擴增條件為，940C變性5min；940C變性30s，570C退火30s，720C延伸45s，30次循環，最后720C延伸增加5min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳證實存在目的條帶，再行產物雜交鑒定和定量。

1.4 微反應板酶聯雜交定量 按Amplicor HBV Monitor檢測試劑盒推薦的方法進行。
　　1.4.1包被 用結合緩沖液（Bb）稀釋共用探針（MXH2 ），序列如下：3''-AGCGTCCAGTCGTCGTTACAC-5''，濃度為500nmol·L-1；取兩份DNA微量條排反應板（微孔板），加入稀釋后的MXH2 ，每孔50uL，封孔后置370 C水浴箱，2hr。
　　1.4.2 預雜交 棄去孔內包被液，一份微孔板中每孔加1×雜交液稀釋的野生片段捕獲探針（Pw），序列如下：5''-TCGCAGGTCAGCAGCATGTGACATCAACTACCAGCACG-3''，濃度為500nmol·L-1，50uL；另一份微孔板中每孔加1×雜交液稀釋的突變引物（Pm），序列如下：5''-GTTGCCCGTTTGTCCTCTACATCACACAAAGATCTACGTCGAC GCAGGACCATGCAAGACCT-3''，濃度為500nmol·L-1，50uL。置 550 C水浴箱，60min后棄液、拍干，并用550 C的洗液Ⅰ洗滌兩次。
　　1.4.3 雜交 將PCR產物用蒸餾水作10倍稀釋， 1000 C解鏈5min后立即置冰浴；加等體積2倍雜交液后取50uL加入雜交孔內，置反應板于480 C水浴箱，60min；用洗液Ⅰ洗三次，每次480 C，3min，棄液拍干。
　　1.4.4 信號檢測 每孔加50uL 1：1000稀釋的鏈親合素-堿性磷酸酶復合物；370 C下放置20min，甩干，用洗液II洗四次，每次370 C，3 min；拍干后用底物對-硝基苯基磷酸二鈉顯色；2h后讀取405nm OD值。

1.5 氧化苦參堿對HBV轉基因鼠的影響 取8-12周齡HBV轉基因鼠26只，雌雄不分隨機分為三組，分別予生理鹽水（A組，9只）、氧化苦參堿50mg· kg-1（B組，8只）、氧化苦參堿100mg· kg-1（C組，9只），腹腔注射，每日一次，30d后處死小鼠，取血清定量測定HBV DAN量。

1.6 統計學處理 所有資料應用SAS軟件進行統計學處理。

2 結 果

2.1 HBV轉基因鼠的HBV DNA整合和復制情況 本文所用的396只HBV轉基因鼠中，共檢測到HBV DNA整合轉基因鼠137只，占34.59%(137/396)，其中血清中復制HBV DNA的轉基因鼠共26只，占6.56%。

2.2 氧化苦參堿治療前后HBV 轉基因鼠中HBV DNA定量檢測結果 氧化苦參堿治療前后HBV 轉基因鼠中HBV DNA定量檢測結果見附表。

　　　　　　　　附表：氧化苦參堿治療前后HBV 轉基因鼠中HBV DNA定量檢測結果（單位：fg· mL-1）

組別 A組 B組 C組
例數 X±S 例數 X±S 例數 X±S
治療前 9 10933.33±5591.06 8 12762.5±4891.96 9 10164.44±5842.93
治療后 9 10864.44±5492.81 8 5898.375±4597.09* 9 2426.33±1563.12**#

注：與治療前相比，* P<0.05，** P<0.01；與A組和B組治療后相比，# P<0.01。

　　從表中可見，A組、B組和C組HBV轉基因鼠在治療前三組HBV DNA量無顯著性差異（P>0.05）；與治療前相比，治療后A組HBV DNA的量無顯著變化（P>0.05），而B組HBV DNA量降低（P<0.05），C組HBV DNA量顯著降低（P<0.01）。C組治療后HBV DNA量明顯低于A組和B組（P<0.01），而B組治療后HBV DNA量低于A組，但統計學無顯著性差異（P>0.05）。

3 討 論

　　HBV轉基因鼠的建立為活體研究HBV致肝癌分子機理研究、肝癌的綜合病因研究、乙型肝炎治療新途徑的探討、抗HBV藥物篩選開辟了一個新的領域[4，5，7，8]。我們用顯微注射法建立的HBV轉基因鼠進行實驗，結果顯示HBV基因組DNA已整合至小鼠基因組，且能有效表達，證明獲得了攜帶HBV全基因組小鼠，本實驗396只HBV轉基因鼠中，共檢測到HBV DNA整合轉基因鼠137只，占34.59%(137/396)，其中血清中復制HBV DNA的轉基因鼠共26只，占6.56%。血清中HBV DNA的存在，說明HBV基因在小鼠體內有復制[4，5]。

　　乙型病毒性肝炎的抗病毒治療至今仍是醫學界的一個難題，即使是被公認為最有效的α-干擾素和拉米夫定等，仍存在病毒持續陰轉率不高、價格昂貴、有一定的不良反應及存在病毒變異等缺陷。所以，尋找新的有效抗病毒藥物，仍為當務之急[5]。氧化苦參堿是從苦參及苦豆子中提取的生物堿，國內學者通過氧化苦參堿的基礎和臨床研究發現氧化苦參堿有抗HBV作用，因此開發和應用我國中草藥資源治療慢性乙型病毒性肝炎，將有十分重要的社會和經濟意義[1]。

　　體外實驗表明[1]，氧化苦參堿對HBV DNA轉染的細胞株2.2.15細胞分泌HBsAg和HBeAg有抑制作用，在一定范圍內隨著藥物濃度增加及作用時間延長，抑制率逐漸增高，在同一濃度和同一作用時間下，都表現為對HBsAg的抑制率高于對HBeAg的抑制率。HBV轉基因鼠體內研究發現[3]，HBV轉基因鼠分別用氧化苦參堿100mg· kg-1、200mg· kg-1、300mg· kg-1 每日一次腹腔注射30d后，肝內HBsAg和HBeAg的量與對照組相比均有明顯的下降，在各劑量組之間無顯著性差異。蔡雄等報道[2]氧化苦參堿治療了64例慢性乙型肝炎患者并與α-干擾素進行了比較，結果顯示HBsAg和 HBV DNA陰轉率分別為44.4%和45.3%，而干擾素治療后HBeAg和 HBV DNA陰轉率分別為46.0%和48.0%，與α-干擾素相比較無差異，表明氧化苦參堿治療慢性乙型病毒性肝炎的療效比較理想。

　　HBV DNA的量直接反映了HBV的復制水平[4]。本實驗觀察了氧化苦參堿（50mg· kg-1和100mg· kg-1）對HBV轉基因鼠血清中HBV DNA的影響，發現這兩種氧化苦參堿濃度對HBV轉基因鼠HBV DNA復制均有抑制作用，結果表明氧化苦參堿對體內HBV DNA復制有抑制作用，這種作用可能是臨床治療HBV感染的基礎。至于氧化苦參堿抑制HBV DNA復制的具體機制尚有待進一步研究。

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