氧化苦參堿抗乙型肝炎病毒的體外實(shí)驗(yàn)研究

    乙型肝炎病毒感染會(huì)導(dǎo)致急慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌，其攜帶者較非攜帶者發(fā)生肝癌的相對危險(xiǎn)率為217[1]。目前，我國人群中HBV的感染率高達(dá)57.6%，其中約1.2億為慢性HBV攜帶者，占我國人口的9.8%左右[2]。而臨床上較為有效的藥物IFN-a，其近期療效中血清HBeAg和HBV DNA陰轉(zhuǎn)率僅為40%左右，且由于一定的副作用及價(jià)格昂貴而使臨床應(yīng)用受限[3]。因此，尋找有效并適合我國國情的抗HBV藥物十分必要。研究表明，氧化苦參堿臨床治療慢性乙型肝炎顯示了較好的近期療效[4]，擔(dān)對其藥理機(jī)制遠(yuǎn)不夠了解。為此，我們用HepG2-2.2.15細(xì)胞為模型，觀察氧化苦參堿體外抗HBV活性，并對其作用機(jī)理作初步探討。

材料與方法

一、 藥物：

　　苦參素注射液（含氧化苦參堿98%，規(guī)格200mg/2ml），寧夏綠谷藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。批號(hào)：寧衛(wèi)藥準(zhǔn)字（1994）第000029號(hào)。IFN-a 2b（商品名：隆化諾，300萬單位/支），上海華新生物高技術(shù)有限公司產(chǎn)品。批號(hào)：（97）衛(wèi)藥試字（蘇新寶）S-02號(hào)。

二、 細(xì)胞培養(yǎng)：

　　HepG2-2.2.15細(xì)胞經(jīng)美國The Mount Sinai Medical Center的Acs教授同意,由衛(wèi)生部分子病毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室聞?dòng)衩方淌诨葙?zèng)。用含20%小牛血清、0.03%L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100IU/ml鏈霉素、380μg/ml G418的DMEM液，置于37°C、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

三、 藥物對HepG2-2.2.15細(xì)胞的毒性試驗(yàn)：

　　通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，了解藥物引起的細(xì)胞毒性作用，根據(jù)Mosmann等建立的MTT比色分析法[5]判定各孔中存活細(xì)胞增殖代謝情況及細(xì)胞毒性反應(yīng)。

四、 藥物應(yīng)用：

　　培養(yǎng)細(xì)胞用胰蛋白酶消化成單個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板（4x104細(xì)胞/孔），加入培養(yǎng)液4ml，于5%CO2培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)48小時(shí)后換入不同濃度含藥培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)不含藥物對照組；每3天換新鮮含藥培養(yǎng)液共4次，換出的細(xì)胞上清液-20°C保存待檢，并收集細(xì)胞提取核心顆粒HBV DNA。

五、 上清液中HBsAg、HBeAg的檢測：
　　
　　采用微粒酶免疫（MEIA）測定技術(shù)（美國ABBOTT公司）檢測。
　　抑制率=（對照組S/N值-藥物組S/N值）/對照組S/N值x100%。

六、 細(xì)胞內(nèi)核心顆粒HBV DNA的提取及定量檢測：

　　參照文獻(xiàn)方法[6]：6孔板干預(yù)細(xì)胞以PBS洗滌兩次，用細(xì)胞裂解液（10mM Tris-HCl pH7.9；1mM EDTA；1% NP-40；50mM NaCl；8% 蔗糖）將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至Eppendorf管中，離心后保留上清，加DNase I、RNase A37°C孵育15分鐘后，以EDTA、PEG8000沉淀核心顆粒。然后重懸沉淀，加裂解液（25mM Tris-HCl pH7.5；10mM EDTA；0.1M NaCl；0.5% SDS；1mg/ml 蛋白酶K）孵育過夜后，酚：氯仿：異戊醇抽提，1/10體積3M NaAc和2倍體積冷無水乙醇沉淀DNA，干燥后溶于50ml雙蒸水中。應(yīng)用bDNA信號(hào)擴(kuò)增試驗(yàn)（QUANTIPLEXTM HBV DNA Assay,CHIRON公司）定量檢測HBV DNA滴度。最低檢測限度為0.7 HBV DNA MEq/ml。

　　測定值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。采用SAS軟件包的Dunnett￠s T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p值<0.05為差異有顯著性。

結(jié) 果

一、氧化苦參堿的細(xì)胞毒性試驗(yàn)：

　　我們檢測了藥物對2.2.15細(xì)胞的毒性作用以消除存活細(xì)胞減少引起的HBV DNA水平下降的可能性。結(jié)果顯示氧化苦參堿在2000mg/ml濃度下，細(xì)胞形態(tài)學(xué)和MTT比色A值比較，實(shí)驗(yàn)組和對照組間無明顯差異，提示在該濃度范圍內(nèi)其對2.2.15細(xì)胞生長無毒性作用。IFN-α 2b在5x104IU/ ml濃度以下未見明顯細(xì)胞毒性。

二、 氧化苦參堿對HBsAg、HBeAg的抑制效果：

　　根據(jù)藥物的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果初步確定了用藥濃度范圍。從表1可見，氧化苦參堿對2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg、HBeAg均有抑制作用，并且隨著藥物濃度增加，抑制率逐漸增高。氧化苦參堿在2000mg/ml時(shí)對HBsAg、HBeAg的抑制率分別達(dá)到40.57%、48.27%。在同一濃度下，都表現(xiàn)為對HBeAg的抑制率高于對HBsAg的抑制率。

三、 氧化苦參堿對HBV DNA的抑制效果：

　　　　　　　　　　　　表1氧化苦參堿對2.2.15細(xì)胞(2x106細(xì)胞)HBsAg、HBeAg和HBV DNA的抑制效果

藥物 濃度 HBsAg抑制率（%） HBeAg抑制率（%） HBV DNA(MEq/ml)
空白對照組  0 0 136.50±6.20
氧化苦參堿(mg/ml) 10 4.05 9.22 134.79±5.45
50  9.92 26.01 128.42±0.45
100  14.19 29.25 83.46±3.12*
500 19.08 33.87 57.16±2.35*
1000  33.02 43.07 38.94±1.16*
2000 40.57 48.27 34.02±0.36*

*與空白對照組比較,P<0.05

　　如表1所示，氧化苦參堿濃度為100～2000 ug/ml時(shí)，能明顯降低2.2.15細(xì)胞胞漿核心顆粒HBV DNA水平（P<0.05），并隨著濃度增加，其對HBV DNA的抑制作用亦增強(qiáng)。

四、 IFN-α2b的抗HBV效果

　　　　　　　　　　　　表2 IFN-α2b對2.2.15細(xì)胞(2x106細(xì)胞)HBsAg、HBeAg和HBV DNA的抑制效果

藥物 濃度 HBsAg抑制率（%） HBeAg抑制率（%） HBV DNA(MEq/ml)
空白對照組  0 0 136.50±6.20
IFN-α 2b（IU/ml） 10 4.77 25.75 134.09±0.14
1x102 12.25 33.36 2.79±0.77*
1x103 28.84 37.48 17.75±2.01*
1x104 38.20 51.80 13.75±1.60*
5x104 42.91 58.68 6.19±0.94*

*與空白對照組比較,P<0.05

　　如表2所示，IFN-α 2b對HBsAg、HBeAg和合成和分泌及2.2.15細(xì)胞胞漿核心顆粒HBV DNA有明顯的抑制作用。

討論

　　HepG2-2.2.15細(xì)胞株是通過將克隆雙體HBV DNA及抗G418抗性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞而建立的[7]，能長期穩(wěn)定地向培養(yǎng)上清液中分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane顆粒，并能產(chǎn)生大量的病毒復(fù)制中間體。雖然用HBV DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞與HBV自然感染存在一定的距離，無法反映由于治療所激活的肝細(xì)胞外效應(yīng)因子如細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞、HBV特異性抗體的作用，但是仍然不失為體外抗-HBV藥物篩選很好的細(xì)胞模型。HBsAg、HBeAg為分泌至2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的可溶性蛋白質(zhì)，間接地反映了病毒復(fù)制狀況；2.2.15細(xì)胞胞漿核心顆粒是HBV的復(fù)制復(fù)合體[8]，核心顆粒HBV DNA是病毒感染復(fù)制最靈敏、最直接的指標(biāo),反映了細(xì)胞內(nèi)非整合的復(fù)制性HBV DNA的變化情況。為此,本研究觀察2.2.15細(xì)胞內(nèi)核心顆粒HBV DNA及分泌的HBV抗原的變化，以判斷氧化苦參堿的療效，同時(shí)結(jié)合病毒復(fù)制周期，大致推斷其作用機(jī)理。

　　本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),氧化苦參堿可明顯降低2.2.15細(xì)胞胞漿核心顆粒HBV DNA的水平，提示其能抑制HBV DNA的復(fù)制。同時(shí)氧化苦參堿對細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌的HBV抗原亦有較強(qiáng)的抑制作用，尤其是在同一濃度下，都表現(xiàn)出對分泌的HBeAg的抑制率高于對HBsAg的抑制率。HBV基因組有4個(gè)開放讀碼區(qū)：S基因區(qū)、C基因區(qū)、P基因區(qū)和X基因區(qū)，分別編碼不同的抗原產(chǎn)物[9]。它們的基因表達(dá)分別由各自獨(dú)立的啟動(dòng)子調(diào)控[10]，HBeAg由3.5kb的前C基因組mRNA編碼產(chǎn)生24KDa的多肽，然后轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體并經(jīng)細(xì)胞蛋白酶剪切后形成16KDa的HBeAg，最后分泌到細(xì)胞外。HBsAg由S基因區(qū)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的2.1kb和2.4kb的mRNA翻譯產(chǎn)生，單獨(dú)或包裝成HBV的外殼再分泌到細(xì)胞外。因此可能由于氧化苦參堿對S基因區(qū)和C基因區(qū)啟動(dòng)子的調(diào)控能力不同，從而對HBeAg的抑制能力優(yōu)于對HBsAg的抑制。結(jié)合以上結(jié)果推測，氧化苦參堿可能直接作用于HBV DNA水平（轉(zhuǎn)錄前水平），亦或干擾了包括逆轉(zhuǎn)錄酶和抗原在內(nèi)的蛋白質(zhì)合成及后加工，所以對HBV DNA及抗原都有較好的抑制作用。

　　我們的研究結(jié)果證實(shí)IFN-α能抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞系HBV的復(fù)制，與既往其他研究報(bào)告一致，并印證我們此次細(xì)胞模型的可靠性。氧化苦參堿能明顯抑制HepG2-2.2.15細(xì)胞HBV DNA的復(fù)制，顯著降低細(xì)胞培養(yǎng)上清液分泌性的HBsAg、HBeAg，證明其具有直接的抗HBV活性。其他有關(guān)研究還提示其還具有免疫調(diào)節(jié)[11]、抗肝纖維化[12]等作用，并且價(jià)格低廉，無明顯毒副作用，因而，無論是單獨(dú)應(yīng)用，亦或設(shè)想與核苷類似物或IFN聯(lián)合治療慢性乙型病毒性肝炎，都可能是一種有潛力的藥物，值得更深入研究。

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