帕金森病與microRNA研究

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）又稱為震顫麻痹，是一種與年齡相關的常見神經系統(tǒng)退行性疾病，由環(huán)境和遺傳因素引起，65歲以上人群患病率為1%~2%。帕金森病臨床表現主要為局限于身體一側的肢體靜止性震顫，伴隨癥狀包括運動遲緩、肌強直及姿勢步態(tài)不穩(wěn)。大部分帕金森病的診斷特征者為散發(fā)性，僅不足10%的患者呈家族性。帕金森病的診斷特征性標志物是存貨的多巴胺神經元中出現嗜酸性蛋白質包涵體，又稱路易小體。目前已發(fā)現18個基因位點和11個治病基因與帕金森病有關，但這些基因如何參與帕金森病發(fā)病尚不完全清楚。闡明這些基因突變所導致的神經系統(tǒng)退行性便的機制，將對延緩帕金森病發(fā)病和治療起著重要的作用。帕金森病癥狀的出現是由于大腦黑質紋狀體致密部多巴胺能神經元（dopaminergic neuron，DN）不斷丟失，導致多巴胺含量的顯著下降。當病變累及腦內其他區(qū)域時，很大一部分患者出現癡呆和幻覺，，有研究表明microRNA（miRNA）與DN分化及生存可能相關。新近研究顯示，miRNA廣泛參與疾病的發(fā)生過程，對基因表達轉錄后調節(jié)和神經細胞表型調控起重要作用，目前已發(fā)現數個miRNA的分布和功能與帕金森病存在相關性，且部分已在帕金森病動物模型中得到證實。我們miRNA與帕金森病研究新近展作一概述。

一、miRNA來源及功能

miRNA是一簇微小的內源性非編碼單鏈RNA調節(jié)分子，長度約20~22個核苷酸，由內源性基因編碼，但不轉錄成蛋白質。然而，miRNA介導的編碼基因轉錄后調節(jié)是通過與靶信使RNA（mRNA）分子的3’非編碼區(qū)（3’untranslated region,3’UTR）結合，根據序列的互補程度，導致靶mRNA轉錄抑制或降解，最終引起蛋白質合成降低。然而最近研究也顯示miRNA具有上調靶基因的功能。

Lee等首先發(fā)現miRNA具有下調線蟲基因表達的功能。隨后研究發(fā)現miRNA廣泛存在于生物界中，包括病毒、植物、蠅類、蟲類、魚類、鳥類、嚙齒類動物及靈長類動物。miRNA的生物合成涉及多個步驟且需要特定的細胞機制。miRNA合成首先開始于細胞核中，主要在RNA聚合酶Ⅱ（另一部分是RNA聚合酶Ⅲ）的作用下，其基因轉錄形成初始miRNA。初始miRNA在細胞核中被核糖酸內切酶Ⅲ Drosha和RNA結合蛋白DiGeorge關鍵區(qū)域8（Di Georgecritical region 8）剪切生成約70個核苷酸長度的發(fā)夾狀前體miRNA。在核糖核酸內切酶Ⅲ Drosha和反式激活應答原件RNA結合蛋白（transactivating response RNA-binding protein）的作用下，運輸到細胞質中的前體miRNA被剪切為約22個核苷酸長度的成熟雙鏈RNA分子該雙鏈RNA開始是穩(wěn)定的，隨后解離成2條單鏈分子，其中1條鏈被降解，而另1條鏈與RNA誘導沉默復合物（RNA-induced cilencing complex）結合。RISC通過與靶mRNA的3’UTR的結合，實現靶mRNA與成熟miRNA的不完全互補，致使靶mRNA降解或者轉錄抑制，最終導致蛋白質表達降低。雖然3’UTR區(qū)是miRNA最常見的作用位點，但蛋白質編碼區(qū)也可存在miRNA的作用位點。

通常每個miRNA可以作用于上百個基因的靶位點，每個miRNA有調節(jié)眾多靶mRNA的潛能。如果1個miRNA表達異常（高于或低于正常水平），大量基因表達將受到干擾。miRNA表達也受多種因素的調節(jié)，非生理情況下，細胞中某個miRNA的轉錄譜可發(fā)生顯著改變。在哺乳動物中miRNA可控制30%~50%蛋白編碼基因的活性，miRNA在細胞發(fā)育、分化、增殖、代謝和凋亡中發(fā)揮重要作用。總之，miRNA網絡是重要的調節(jié)機制，能更好地協調基因表達的調控。

二、帕金森病與miRNA

目前已經發(fā)現多個miRNA的人類和黑猩猩的腦組織中表達，高通量序列分析顯示至少有1000個miRNA在人類大腦中表達。miRNA表達在大腦發(fā)育過程中并非恒定的，一些miRNA在哺乳類動物大腦早期發(fā)育中含量相對較高，而另外一些則在哺乳類動物大腦早期發(fā)育中含量相對較高。盡管目前僅少量腦特異性表達的miRNA其特定功能被鑒定，但研究表明miRNA在大腦的發(fā)育和功能中發(fā)揮重要作用，參與調節(jié)神經干細胞的分化、神經突的生長及突觸的形成。

帕金森病患者中腦黑質紋狀體DN的丟失，導致紋狀體釋放多巴胺不足及基底節(jié)對大腦運動皮質刺激減少研究顯示miRNA與DN的分化可能有關，特異性剔除Dicer阻礙miRNA的合成，導致胚胎干細胞分化成中腦DN的能力降低。胚胎鼠中腦分離出的小RNA（包括miRNA）轉染特異性剔除Dicer的小鼠，改剔除Dicer小鼠中腦DN可部分出現分化，提示miRNA與DN分化及生存可能相關，但尚不清楚miRNA與人類帕金森病的發(fā)生是否有關。此外，特異性剔除小鼠中腦DN的Dicer，導致DN凋亡增加及神經退行性病變，中腦的DN進行性丟失，甚至黑質紋狀體中DN丟失可高達90%，動物表現出運動能力降低類似帕金森病患者的運動障礙。這些研究提供了miRNA可能參與P帕金森病的發(fā)生及發(fā)展的證據。目前，主要發(fā)現以下幾種miRNA可能與帕金森病相關。

2003年Dostie等發(fā)現miR-175基因定位于人類X染色體上，而該定位區(qū)域是早發(fā)型帕金森綜合征的候選區(qū)域，故miR-175可能涉及帕金森病的發(fā)病。

2007年Kim等法中中腦DN特異性表達miR-133b，丟失DN的帕金森病患者中腦組織缺乏miR-133b的表達。Mir-133b通過調節(jié)同源結構轉錄因子3（Pitx3）的表達來調控中腦DN的成熟及功能。Pitx3特異性誘導miR-133b的轉錄，而miR-133b的又反過來抑制Pitx3的活性。體外實驗發(fā)現，miR-133b的耗竭增加DN標志物的表達和去極化誘導的多巴胺釋放，而miR-133b過度表達抑制DN神經元充分分化并導致多巴胺釋放顯著減少。盡管miR-133b在帕金森病患者中表達減少，但miR-133b并不是胚胎干細胞Dicer表型及小鼠Dicer突變體進行性丟失DN的主要因素，帕金森病可能源于Pitx3依賴基因逼到的缺失而非miR-133b。因此，miRNA對DN退行性病變的保護作用有待進一步證實。2010年de Mena等發(fā)現西班牙白人miR-133b（包括miR-133b）和Pitx3的DNA變異魚帕金森病發(fā)生無顯著相關性，盡管這些基因的變異和（或）多態(tài)可能涉及DN的存活。

2008年Wang等發(fā)現美國白人miR-433在單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）rs12720208處抑制成纖維細胞生長因子20（FGF20）的轉錄。FGF20主要在黑質紋狀體中表達并且有促進DN生存的功能，SNP rs12720208位于FGF20基因的3’UTR區(qū)，是miR-433的結合位點。SNP rs12720208與帕金森病發(fā)生的危險性相關，rs12720208風險等位基因阻礙miR-433的結合位點，使FGF20的轉錄增加。細胞培養(yǎng)使用及帕金森病患者的腦組織中，FGF20的轉錄增加導致α-突觸核蛋白（SNCA）的過度表達。而SNCA是公認的帕金森病發(fā)病的一個關鍵因素，SNCA的過度表達是帕金森病患者的一個共同特點。帕金森病患者神經細胞中異常聚集的路易小體主要由SNCA組成，路易小體是帕金森病神經病理學的一個貼點切實診斷帕金森病的特征性標志物。因此，miR-433可能與帕金森病的發(fā)病相關。但2010年 de Mena等發(fā)現西班牙人FGF20 SNP rs12720208與帕金森病發(fā)生的危險性無關，miR-433的DNA變異也極少與帕金森病發(fā)生的危險性相關，并且在西班牙帕金森病患者中沒有發(fā)現miR-433的核苷酸變化。故該研究結果又待進一步確認。

2009年Junn等發(fā)現miR-7主要在神經細胞中表達，miR-7與SNCA的mRNA 3’UTR結合，抑制SNCA的表達，從而保護細胞對抗SNCA誘導的蛋白酶抑制及毒性。隨后的研究顯示，在1-甲基-4苯甲-1,2,3，6-四氫吡啶（MPTP）誘導的帕金森病模型中，miR-7表達降低可能導致SNCA的增加表達。這些提示miR-7可能通過上調SNCA表達而參與帕金森病的發(fā)病。2010年Doxakis發(fā)現miR-7和miR-153參與SNCA的轉錄后調節(jié)，與SNCA的mRNA 3’UTR結合下調SNCA的mRNA及蛋白質水平。miR-7、miR-153與SNCA協同表達與神經細胞中，通過轉錄前饋回路調節(jié)SNCA的表達。miR-7和miR-153在中腦和但皮質中高表達，人類年齡和（或）環(huán)境因素可能導致miRNA的表達改變，從而增加SNCA的表達水平及帕金森病發(fā)病風險。

三、miRNA在帕金森病動物模型中的研究

2007年Kim等研究發(fā)現正常小鼠中腦特異性表達miR-133b，類似于人類，在無晶狀體小鼠和6-羥多巴（6-OHDA）處理的小鼠中表達降低，無晶狀體小鼠下降尤為明顯。無晶狀體小鼠是自然發(fā)生的突變體，其體內缺乏Pitx3基因，而Pitx3是中腦DN發(fā)育分化及存活所需的重要同源域轉錄因子，Pitx3的多態(tài)性與人類的帕金森病相關。miR-133b與Pitx3形成一個負反饋環(huán)調節(jié)DN的發(fā)育及功能，然而目前未發(fā)現缺乏miR-133b的小鼠突變體，故不能確定miR-133b的缺失與帕金森病的發(fā)病存在直接關聯。

2009年Junn等發(fā)現miR-7主要在小鼠神經細胞中表達，并且能保護SNCA突變（A53T）小鼠，對抗SNCA誘導的蛋白酶抑制及毒性，但需要SNCA野生型3’UTR的參與。隨后研究發(fā)現在MPTP神經毒素誘導的帕金森病小鼠模型中miR-7表達下降，提供了miR-7通過上調SNCA表達涉及MPTP模型黑質紋狀體系統(tǒng)退行性變的證據。

2010年Asikainen等用miRNA微陣列法現在3種帕金森病相關的線蟲模型中miRNA基因表達的變化：其中12個特異性miRNA在SNCA突變（A53T）體中、5個囊泡兒茶酚胺轉運體突變（cat-1）線蟲紅、3個在帕金森同源基因（pdr-1）突變線蟲中差異表達。在SNCA轉基因線蟲及cat-1中，miR-64和miR-65表達境地，miR-58過度表達。Let-7家族成員let-7、miR-48和miR-84在SNCA突變體及pdr-1突變體中均表達降低，對這些miRNA的靶位點的分析提示miRNA介導的保護機制與帕金森病的發(fā)病相關。

四、展望

帕金森病是一類發(fā)病機制賦值的神經退行性疾病，目前尚無置于的有效方法，藥物治療僅僅能減輕癥狀，難以延緩疾病的進程，一定程度上是由于對帕金森病發(fā)生的細胞分子機制了解有限，基因多樣性、環(huán)境復雜性及大腦自身老化，加大了闡明帕金森病發(fā)病機制的艱巨性，但最新證據表明miRNA與帕金森病的發(fā)病有關。盡管目前帕金森病領域有關miRNA的研究較少，但深入研究帕金森病患者腦中miRNA的表達改變將有利于闡明miRNA在帕金森病發(fā)病中的作用，進而為帕金森病的治療提供新的基因及藥物靶點。（文獻：高凱  鄭文  鄧昊  《帕金森病與microRNA研究》 中華神經科雜志2012年12月第45卷第6期）

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