慢性蕁麻疹患者相關性研究

    慢性蕁麻疹（chronic urticaria）病因復雜，部分患者發病與自身免疫有關，但具體機制尚未完全明確。有研究表明，慢性蕁麻疹患者血清中補體參與了嗜堿粒細胞或肥大細胞組胺釋放、白三烯等炎癥介質活化過程，紅細胞補體受體是1（complement receptor type1，CR1）即紅細胞C3b/C4b受體，是補體受體中的重要成員，亦是紅細胞天然免疫的重要基礎。我們檢測了慢性慢性蕁麻疹患者和健康人外周紅細胞CR1及IgE、 C3、C4和CH50的含量，初步探討紅細胞天然免疫在慢性蕁麻疹的表達與健康對照組是否存在差異。 

    對象與方法 
    2010年6月至2011年6月在廣州軍區武漢總醫院皮膚性病科門診就診的慢性蕁麻疹患者59例，其中人工劃痕癥14例，慢性特發性蕁麻疹45例；男39例，女29例，平均年齡34.3（18~45）歲。入選標準：患者1周內未使用過抗阻胺藥物，1個月內未用過糖皮質激素及其他免疫抑制劑；無濕疹、接觸性皮炎、過敏性皮炎等過敏性疾病病史；近期無局部及全身感染。另選本院健康體檢者全血29例，其中男16例，女13例，平均年齡36.2（20~50）歲。兩組間性別、年齡分布差異無統計學意義。本實驗已經廣州軍區武漢總醫院倫理委員會審核通過。 

    二、主要試劑盒儀器 
    FACS Calibur流式性別儀（美國Becton Dickinson公司），雷杜RT—6000酶標儀（上海伍可工貿有限公司），CX4貝克曼全自動化分析儀（美國Beckman Coulter公司），鼠抗人CR1（CD35）單克隆抗體、免抗屬IgG—FITC（圣克魯斯生物技術上海有限公司），CH50 ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。 

    三、方法 
    1、標本采集及處理：研究對象均于早晨空腹菜跗
靜脈血5ml，其中3ml全血放于肝素抗凝管中，4 °c冰箱保存，待流式細胞儀檢測；另2ml置于干燥管中，2500r/min低溫離心15min,，吸取上清液，置于-20°c保存待檢。 
    2、CR1表達檢測：10µl抗凝血用磷酸鹽緩沖液（PSC）作1:200稀釋后，在干凈的微量離心管中加入1mlPSB、20µl一抗（鼠抗人CR1抗體）、100µl、稀釋的抗凝血，37°c乳育30min，1000r/min離心40min。棄上清液，用PBS洗滌離心3次，在沉淀的紅細胞中加入1mlPBS及20µl二抗（兔抗鼠IgG—FITC），37°c乳育30min。洗滌3次后加入PBS1ml，上流式細胞儀檢測10000個紅細胞表面的熒光強度。 
    3、血清CH50測定：取血清分離后上清夜，96孔酶標板每孔加入稀釋好的標準品50µl于反應孔、血清10µl于反應孔內，標準孔按試劑盒說明書操作。輕輕振蕩搖勻，37°c溫育1h。洗滌5次后加酶標抗體每孔50µl，37°c溫育30min后洗滌5次。加入顯色劑避光顯色15min。在45nm處測定各孔的A值，并由酶標儀軟件讀出濃度值。濃度×稀釋倍數即為樣本CH50的含量。 
    4、血清IgE及C3\C4測定：采取雙抗體夾心ELISA法。 

    四、統計學處理 
    采用CPSS13.0統計軟件包，健康對照組、人工劃痕癥組與慢性特發性蕁麻疹組三組間樣本均數的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），健康對照組與慢性蕁麻疹組三組間均數的比較采用獨立樣本t檢驗。相關分析采用Pearson。
結果 
    一、 外周血紅細胞CR1的表達 
    健康對照組與慢性特發性蕁麻疹組、人工劃痕癥組間外周血紅細胞CR1的表達行one-way ANOVA分析，F=10.19，P=0.01，3組差異有統計學意義（p＜0.01）。健康對照組與慢性蕁麻疹組間獨立樣本t檢驗，t=4.10，p＜0.01。 

    二、 外周血IgE水平檢測 
    健康對照組與人工劃痕癥組、慢性特發性蕁麻疹組外周血IgE水平差異有統計學意義(P<0.05)，人工劃痕組與慢性特發性蕁麻疹組間差異有統計學意義(P<0.05)。 

    三、 慢性特發性蕁麻疹血清IgE總C3、C4和CR1的相關性分析
將慢性特發性蕁麻疹患者按IgE含量分為3組，IgE<240µg/L組22例，其中CR1為24.45±10.83；IgE240~500µg/L組20例，CR1為33.09±11.86。采用one-way ANOVA分析，F=3.94，P<0.05;LSD法進行兩兩比較，IgE<240µg/L組與>500µg/L CR1組差異有統計學意義（p＜0.01）。慢性蕁麻疹患者血清總IgE與CR1呈顯著,正相關（r=0.27，P<0.05），CR1與血清C3（r=0.16）、C4（r=-0.08）無顯著相關性（P值均>0.05），C3與C4呈正相關（r=0.54，p＜0.01）。3組C3、C4和CH5水平經one-way ANOVA檢驗，差異均無統計學意義（P值均>0.05）。

    討論 
    天然免疫與獲得性免疫網咯關系是當前免疫學的熱點研究之一。紅細胞已被證實是體內數量最多的一種天然免疫細胞，參與T淋巴細胞、LAK細胞、NK細胞、吞噬細胞的免疫功能的調節，在機體免疫反應和疾病發生發展中都具有十分重要的意義。CR1除分布于紅細胞外，還分布于粒細胞、單核細胞、肥大細胞、綠泡樹突細胞、賢小球足突細胞、B細胞及部分CD T細胞等。血循環中85%的CR1都存在于紅細胞膜上，具有多種免疫作用，參與補體活化調節。

    CR1（CD35）是相對分子質量為180000~260000的單鏈多態性跨膜糖蛋白，屬于補體激活調節因子家族成員，是血紅細胞免疫功能最重要的物質基礎之一，其表達的高低直接影響循環免疫復合物（CIC）的清除。表達越多者活躍越高，清除CIC能力也越強表達越多者活性越高，清除CIC能力也越強，其表達形式由CR數量基因多態性（Hindl多態性）遺傳決定，也受后天多種因素影響。大量研究表明，大多數免疫相關疾病患者CR1分子與CIC的結合力及紅細胞膜上CR1分子是下降的，如腫瘤、類風濕性關節炎已經系統性紅斑狼瘡。提示紅細胞CR1的減少將引起免疫復合物儲存、運輸障礙，可能是自身免疫性疾病發病和使病情加重原因之一。
本實驗結果表明，健康對照組與人工劃痕癥組、慢性特發性蕁麻疹組外周血紅細胞CR1的表達差異有統計學意義，說明慢性蕁麻疹患者血清中CR1表達較健康對照組高，此結果與白杰明等的研究相一致。提示CR1可能參與慢性蕁麻疹的發生，紅細胞CR1分子數量及其活性的增加，可能是慢性蕁麻疹患者紅細胞天然免疫功能存在亢進和紊亂。

    在此基礎上我們觀察到，慢性蕁麻疹患者血清IgE與紅細胞CR1呈顯著正相關，且慢性蕁麻疹患者IgE<240µg/L組與>500µg/L組間CR1含量差異有統計學意義。表明當CR1表達增高到一定程度時，IgE含量升高。當致病原抗原進入血液后，首選溶于血漿并被補體調理，被血紅細胞上為數眾多的補體受體CR1（CD35）所黏附，通過紅細胞上的CD58、CD59與淋巴細胞CD2共刺激分子相結合，進而激活并促進淋巴細胞等適應性免疫細胞產生免疫效益應。
CR1分子的數量既與先天基因表達有關，又受后天影響。先天性的因素主要為疾病本身基因多態性變化，后天性因素主要為自身免疫性疾病嚴重的程度，特別是CIC產生的速度、數量和持續時間長短。本研究結果表明，紅細胞CR1在慢性蕁麻疹患者中的表達存在異常，紅細胞表面的CR1與IgE之間的關系及病理過程中的調節機制值得進一步深入研究。
（羅穎等,慢性蕁麻疹患者紅細胞補體受體1分子表達及外周血IGE和補體C3\C4水平的相關性研究[J]中安皮膚科雜志2012年12月第45卷第12期）

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