復(fù)方鱉甲軟肝片抑制大鼠酒精性肝纖維化作用機制研究

    本實驗采用“白酒-吡唑-玉米油”混合液灌胃法復(fù)制動物模型,觀察復(fù)方鱉甲軟肝片的抗纖維化作用,并探討其對轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的影響及抗酒精性肝纖維化作用機制。

　　1 實驗材料

　　1.1 動物

    清潔級雄性Wistar大鼠40只,體重(200±10)g,購于北京維通利華公司,許可證號：SCXK2004～2005。

　　1.2 主要藥物及試劑

    復(fù)方鱉甲軟肝片由鱉甲、赤芍、冬蟲夏草、三七、紫河車、連翹、當(dāng)歸、莪術(shù)、黨參、黃芪和板藍根組成,內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產(chǎn),批號20020501,用前以生理鹽水溶解；安琺特,黑龍江衛(wèi)世醫(yī)藥有限公司生產(chǎn),國藥準(zhǔn)字：H23023289。透明質(zhì)酸(HA)、Ⅳ型膠原(CⅣ)及層粘連蛋白(LN)放免試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所。TGF-β1兔抗多克隆抗體(Santa Cruz),辣根酶標(biāo)記的羊抗兔二抗,DAB顯色系統(tǒng),均購自北京中山生物技術(shù)公司。

　　2 實驗方法

　　2.1 分組及造模

    將大鼠隨機分成正常組、模型組、中藥組和西藥組,每組10只。模型組、中藥組、西藥組采用“白酒-吡唑-植物油”混合液灌胃法復(fù)制動物模型[1],每只大鼠灌胃白酒4.8 g/(kg·d)、吡唑24 mg/(kg·d)、玉米油2 mL/(kg·d)的混合液,灌胃16周。在灌胃白酒混合物的同時飼喂高脂飼料(基礎(chǔ)飼料-膽固醇-豬大油＝79∶1∶20)。正常組每日用生理鹽水灌胃,普通飼料喂養(yǎng)。

　　2.2 給藥

    中藥組灌胃鱉甲軟肝片,給藥量0.54 g/(kg·d),西藥組灌胃安琺特,給藥量21.6 mg/(kg·d),2組均相當(dāng)于人臨床用量的5.4倍,均治療4周。正常組及模型組每日灌胃2 mL生理鹽水。

　　2.3 觀測指標(biāo)

    造模16周后,正常組和模型組大鼠尾靜脈采血,分離血清,用放免分析法測定血清中HA、LN及CⅣ含量。治療4周后,正常組、模型組、中藥組和西藥組大鼠尾靜脈采血,分離血清,測定血清中HA、LN及CⅣ含量。治療4周后,取各組大鼠肝組織,常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色、光鏡觀察,TGF-β1免疫組化染色實驗也采用該套石蠟塊。

　　3 統(tǒng)計學(xué)方法

    應(yīng)用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料用x±s表示,2組間比較采用t檢驗,多組間比較采用方差分析,各組間兩兩比較采用LSD檢驗。

    4 結(jié)果

　　4.1 用藥前后大鼠血清中透明質(zhì)酸、IV型膠原及層粘連蛋白檢測結(jié)果

  　(見表1、表2)表1 用藥前2組大鼠血清中HA、LN和CⅣ含量比較(略)注：與正常組比較,*P＜0.05表2 用藥后各組大鼠血清中HA、LN和CIV含量比較(略)注：與正常組比較,**P＜0.01；與模型組比較,▲▲P＜0.01

　　4.2 大鼠肝組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1蛋白表達免疫組化染色結(jié)果

    本實驗采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測了正常組、模型組、中藥組及西藥組大鼠肝組織中TGF-β1蛋白的表達情況,結(jié)果顯示,正常組大鼠肝組織中TGF-β1蛋白僅有少數(shù)散在肝細(xì)胞陽性表達；模型組大鼠肝組織中TGF-β1蛋白肝細(xì)胞彌漫強陽性表達；中藥組大鼠肝組織中TGF-β1蛋白部分肝細(xì)胞陽性表達；西藥組中央靜脈周圍及肝小葉內(nèi)較多肝細(xì)胞陽性表達。大鼠TGF-β1肝組織免疫組化染色結(jié)果初步顯示,復(fù)方鱉甲軟肝片和安琺特均能顯著下調(diào)大鼠肝組織中TGF-β1蛋白含量,且復(fù)方鱉甲軟肝片優(yōu)于安琺特。結(jié)果見圖1。

　　4.3 大鼠肝組織石蠟切片Mallory染色光鏡觀察結(jié)果

    肝組織中的膠原經(jīng)Mallory染色,光鏡下呈藍色。正常組大鼠肝組織中僅有少量膠原表達,肝細(xì)胞及匯管區(qū)、中央靜脈及竇周圍幾乎不見膠原纖維；模型組大鼠肝組織內(nèi)膠原水平顯著提高,中央靜脈及匯管區(qū)輕度纖維化；中藥組及西藥組大鼠肝血竇周圍膠原明顯減少,相鄰血竇間的纖維聯(lián)絡(luò)基本消失。Mallory染色初步表明,復(fù)方鱉甲軟肝片在降低肝組織膠原含量上療效接近安琺特。

    本實驗結(jié)果顯示,與正常組相比,模型組大鼠肝臟組織HA、TGF-β1蛋白表達和CⅣ表達顯著增強,提示HA和TGF-β1參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,進一步證實TGF-β1在肝纖維化過程中起重要作用；中藥組的肝纖維化程度較模型組減輕,肝組織HA、TGF-β1蛋白表達和CⅣ表達亦顯著減弱,提示抑制纖維化肝組織HA、TGF-β1蛋白表達可能是復(fù)方鱉甲軟肝片的抗肝纖維化的作用靶點之一。復(fù)方鱉甲軟肝片可能通過下調(diào)TGF-β1表達,抑制膠原的合成和降解,從而達到逆轉(zhuǎn)纖維化的目的。

    參考來源：《中國中醫(yī)藥信息雜志》 2009年05期 李豐衣 孫勁暉 田德祿 祝世功 潘慧 劉霞 王慶寶 中國人民解放軍第302醫(yī)院;北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院;北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部;衛(wèi)生部中日友好醫(yī)院;泰山醫(yī)學(xué)院;

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