綜述：病毒性肝炎的基因治療

 

 

    引起病毒性肝炎的病原體主要是肝炎病毒，包括甲型肝炎病毒（HAV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、丁型肝炎病毒（HDV）、戊型肝炎病毒（HEV），近年來的研究表明，GB病毒（GBV）/庚型肝炎病毒（HGV）和輸血傳播病毒（TTV）。最近報導國外發(fā)現(xiàn)了SEN病毒（SENV），可能是解釋目前仍有10~15%的病毒性肝炎患者病原學不清的問題。無論是那一種肝炎病毒感染引起的急性、慢性病毒性肝炎，根本原因是病毒復制和表達的存在，病毒的抗原誘發(fā)機體的免疫原理反應，造成肝臟炎癥損害。因此，要從根本上解決病毒性肝炎的問題，從基因水平上，尋求阻斷、抑制、甚至是清除肝炎病毒，是非常重要的思路。基因治療是生物醫(yī)學領域中研究的一個熱點。

 

　　一、 基因治療的概念和策略

 

　　基因治療就是用正�；蛞吧�型基因校正或轉換缺陷或致病基因的一種分子生物學水平的治療方法。傳統(tǒng)意義上的基因治療（gene therapy），是指目的基因導入靶細胞以后與宿主細胞內的基因發(fā)生整合，成為宿營主細胞遺傳物質的一部分，目的基因的表達產(chǎn)物起到對疾病的治療作用。近些年來，采用某些基因轉移技術，即使目的的基因和宿營主細胞的基因不發(fā)生整合，目的基因也可得到暫時表達。目的基因的表達產(chǎn)物也具有一定的治療作用。這種基因治療中應用的目的基因應象我們平常在臨床上使用的藥物一樣。為了與傳統(tǒng)意義上的基因治療相區(qū)別，這種目的基因不與宿主細胞基因組發(fā)生整合，暫時表達產(chǎn)物發(fā)揮治療作用的基因治療方法叫做基因療法（gene therapeutics）。

 

　　基因治療中根據(jù)針對宿主病變細胞基因采取的措施不同，又分為基因轉換（gene replacement），基因修正（gene correction），基因修飾（gene augmentation），基因滅活（gene inactivation）和基因疫苗（gene vaccine）等五大策略。基因滅活和基因疫苗是阻斷和抑制肝炎病毒基因復制和表達的重要基因治療手段�；�因治療的條件包括：目的基因的獲得，靶細胞的選擇以將目的基因導入窠主細胞基因轉移的高效手段�；�因治療的步驟包括：目的基因的準備、受體細胞的培養(yǎng)、載體的選擇、將目的基因導入到靶細胞等。

 

　　二、 病毒性肝炎的基因治療

 

　　基因治療在抗腫瘤，遺傳性疾病和傳染病的治療中有十分重要的應用前景，近年來的研究表明，基因治療在病毒性肝炎的治療中也能發(fā)揮重要的影響。病毒性肝炎的基因治療研究雖然取得了一系列的進展，但是，由于病毒性肝炎的發(fā)病機制還沒有完全了解清楚，目前基因治療在病毒性肝炎治療中的應用遠未達到最高水平。病毒性肝炎的基因治療一方面取決于基因治療技術本身發(fā)展的速度和狀態(tài)，另一方面也取決于病毒性肝炎發(fā)病機制本身研究的深入程度。

 

　�。ㄒ唬� 淋巴因子轉基因表達

 

　　淋巴因子在傳染病治療中具有十分重要的作用和廣泛的應用前景。其中的干擾素（IFN）已成為目前抗肝炎病毒治療唯一公認有效的基因工程藥物。利用淋巴基因表達進行傳染病的基因治療研究，是基因治療在傳染病中的一個重要應用和重要的研究方向。

 

　　1、 干擾素的基因轉移與表達

 

　　Seif等將小鼠的干擾素β（IFNβ）的基因置于主要組織相容性復合體（MHC）的啟動子序列的控制之下，構建重組表達載體，轉染Babl/c小鼠的成纖維細胞系NIH3T3，得到了持續(xù)的IFNβ的表達。表達IFNβ的細胞系，對濾泡口炎病毒（VSV，vesicular stomatitis virus），腦心肌炎病毒（EMCV，encephalomy-ocarditis virus）和塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus）的復制和表達均有明顯的抑制作用。并發(fā)現(xiàn)持續(xù)低水平的IFNβ的分泌表達，就可以使這一細胞系產(chǎn)生明顯的抗病毒狀態(tài)。然而，用等量的外源重組的IFNβ則無此效果。而且，加入相應的IFNβ的單克隆抗體并不能阻斷這種轉導的細胞系對上述三種病毒的抑制效應。因此認為，此細胞系的抗病毒狀態(tài)的產(chǎn)生，除了和分泌型IFNβ的表達有關以外，還有可能存在其它的作用方式。另外，Bednarik等將人的α2干擾素（IFNα2）的基因重組到人免疫缺陷病毒（HIV）的長未端重復序列（LTR）中的啟動子下游，轉入非洲綠腎細胞系中，IFNα2的分泌表達水平持續(xù)在50~150u/ml之間。這一低水平的IFNα2的表達完全可以抑制HIV的復制和轉錄。同樣地也發(fā)現(xiàn)就用相應水平的外源重組的IFNα2也無此效果。而且IFNα2的單抗也不能阻斷IFNα2的抗病毒作用。這一差別的原因，作者認為體內產(chǎn)生的IFNα2與體外重組的IFNα2的抗病毒機理不同。外源重組的IFNα2的抗病毒機理，是抑制HIV的成熟和裝配過程，而內源表達的IFNα2的抗病毒作用，似乎是主要作用在轉錄水平以及HIV mRNA的穩(wěn)定性等方面。

 

　　2、 白細胞介素-2的轉基因表達

 

　　Guidotti等應用HBV DNA轉基因小鼠，證實IL-2對HBV DNA轉錄的2.1kb的mRNA具有明顯的抑制作用。認為IL-2對HBV DNA轉錄2.1kb mRNA的啟動子活性有明顯的負調控作用。同時，還通過腫瘤壞死因子（TNF）和γ干擾素（IFNγ）的誘生達到抗病毒的效果。因為肝細胞膜上沒有IL-2的受體，所以認為IL-2的抗病毒作用是其對HBV DNA啟動子活性的直接抑制使用來實現(xiàn)的。并且認為IL-2抑制HBV DNA的表達是在轉錄后水平上發(fā)生的。

 

　�。ǘ�） 寡腺苷酸合成酶轉基因表達

 

　　Chebath 等構建了2''''-5''''AS的真核表達載體，和作為標志基因的二氫葉酸還原酶（dhfr）基因的表達載體以共轉染的方式，導入到中國倉鼠卵母細胞（CHO）中，得到了2''''-5''''AS的表達。這一轉導的細胞系和其親本細胞相比較，具有顯著的抗小RNA病毒的能力，如門果病毒（mengovirus）等的感染。這一研究結果表明，表達2''''-5'''' AS的細胞系可以繞過IFN的誘生，僅僅靠2''''-5'''' AS的表達也能產(chǎn)生顯著的抗病毒效應。這種2''''-5'''' AS誘生在IFN抗病毒治療中是有普遍意義的。因此，這是一個很有價值的探索方向。

 

　�。ㄈ�） 病毒抗原編碼基因的轉基因表達

 

　　Felgner等首先將HIV的糖蛋白gp120的基因與巨細胞病毒（CMV）的即刻早期（IF,immediate early）啟動子序列重組，構建了表達gp120的重組表達載體。將這種重組表達載體的質鑿DNA進行肌肉注射，一部分細胞可獲得這種DNA而進行表達gp120。作為一種抗原，機體可以產(chǎn)生免疫保護性抗體。這種特異性的免疫應答是防治HIV的重要途徑之一。Morin等也得到類似的結果。

 

　　（四） 保護性抗體的基因導入與表達

 

　　HIV感染CD4+細胞并使其破壞，造成CD4+細胞的數(shù)量減少，甚至完全喪失。以至于與之相關的免疫功能缺陷。保護CD4+細胞不受感染，其中的一種策略就是利用基因治療技術導入HIV-1抗體的基因進行表達，中和HIV的感染性，Marasco等導入了針對HIV-1的單鏈抗體基因，可以特異性地與HIV-1的包膜糖蛋白相結合，以抑制或阻斷HIV的感染能力。以HIV的cDNA的單鏈抗體的編碼基因共轉染T淋巴細胞中，其中HIV表達其核心蛋白（gag）的水平變化不大，但產(chǎn)生具有感染能力的HIV病毒顆粒的數(shù)量卻顯著降低。最近，Pomerantz等研究資料表明，抗Rev的單鏈抗體的表達，在細胞漿中可以捕獲Rev蛋白，并且可以抑制HIV的表達。提示以HIV抗體的編碼基因作為目的基因進行抗病毒基因治療，是一個有希望的途徑。但是，HIV可以編碼多種結構和調節(jié)蛋白，作為抗原可以引發(fā)機體產(chǎn)生不同的抗體，為了優(yōu)化細胞內抗體的表達，抗HIV感染的基因治療的策略，必須對各種可能的抗體抑制或阻斷HIV感染的效果進行比較，以獲得較為理想的基因治療效果。

 

　�。ㄎ澹� 阻斷病毒進入細胞的過程

 

　　HIV感染并進入宿主細胞，必需借助其包膜糖蛋白pg120與宿主淋巴細胞膜上的CD4抗原相結合，這也是HIV選擇下破壞CD4+細胞的重要原因。因此以過量的CD4抗原分子和HIV的包膜糖蛋白gp120，就可以阻斷和抑制HIV的感染能力。由此保護未受感染的CD4+細胞。只要保證CD4+細胞的合適數(shù)量，HIV感染者就不會發(fā)展成嚴重的免疫缺陷，招致嚴重的機會性感染。Fischer等均可溶性CD4+（sCD4）分子的編碼基因導入到體外培養(yǎng)的T淋巴細胞中，sCD4分子確實可以阻斷HIV-1的感染。免疫系統(tǒng)中CD4分子的正常功能與主要組織相容性復合體（MHC Ⅱ）型分子的免疫識別密切相關。因此，應用這種sCD4分子干擾HIV-1與CD4+細胞結合來進行抗病毒基因治療，擔心會干擾MHC Ⅱ特異性T細胞的功能。轉基因小鼠的研究結果表明，這種擔心實際上是沒有根據(jù)的。Weber等建立了表達sCD4分子的轉基因小鼠品系，持續(xù)表達sCD4分子達100ug/ml，但如此高水平的sCD4分子的表達，并沒有影響小鼠CD4+細胞對同各異型抗原或抗-CD3抗體刺激的免疫識別和免疫應答。

 

　　另外，輔助性T細胞介導的體內抗體的應答機制，也不受sCD4分子過表達的影響。Morgan等曾應用逆轉錄病毒表達載體-包裝細胞系基因轉移系統(tǒng)，將sCD4的編碼基因導入到人T淋巴細胞中進行表達，可以明顯抑制HIV-1的感染。最近，sCD4與免疫球蛋白融合基因的表達，也獲得了明顯的抗HIV-1的效果。但是，以sCD4基因作為目的的基因的抗HIV-1基因治療I期臨床實驗卻未取得預期的成功。從臨床標本中分離到了抗sCD4分子的抗性HIV-1病毒株，從一個側面解釋了其中的一個原因。實驗證實，中和sCD4抗性株所需要的sCD分子數(shù)是sCD4敏感株的200-2700倍。因此，考慮到利用sCD4編碼基因作為目的基因進行抗病毒基因治療時，必須考慮到基因轉移與表達調控的技術之外，還要考慮到sCD4分子本身的一些性質和特點。

 

　　近年來，有關HIV-1感染的發(fā)病機制研究領域中最為令人興奮的發(fā)現(xiàn)之一就是HIV-1感染，必須借助輔助分子（cofactor）融合素（fusin），即CC CKR5這種趨化因子受體的參與。因為HIV-1不僅可以高效地感染CD4-細胞系，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染等，而且，將CD4分子的編碼基因轉染CD4-的細胞系，使其表型由CD4-變?yōu)镃D4+，也不能導致其對HIV-1感染的敏感性增加。最后也想到了輔助分子的可能性。為此，各國科學家為之奮斗了整整8個春秋，才從眾多的候選分子中確認融合素是HIV感染宿主細胞的必須結合的輔助分子。這一重要發(fā)現(xiàn)，必須會導致抗HIV感染新療法的出現(xiàn)。針對融合素分子抗體的基因治療以及融合素基因特異性的核酶（ribozyme）的分子設計，將是抑制或阻斷HIV感染靶細胞的基因治療手段。

 

　　關于HBV的受體一直認為PHSA-R是HBV感染靶細胞的受體分子，但這種觀點也存在嚴重的不足。最近的研究結果表明，附加素V（annexin）可能是HBV感染靶細胞的另一個受體分子。關于HCV受體的研究，發(fā)現(xiàn)CD81這種跨膜分子，可能是HCV感染靶細胞的受體分子。根據(jù)肝炎病毒的受體分子的性質，可能是探索抗肝炎病毒治療方法的重要思路，但目前還沒有實質性進展。

 

　　（六）、細胞內免疫

 

　　Malim等根據(jù)HIV-1的反式激活Rev蛋白的結構特點，設計了抗HIV-1基因治療的細胞內免疫策略。Rev蛋白富含亮氨酸的羧基未端是其反式作用的絕對依賴區(qū)。此區(qū)的突變體作為野生型Rev蛋白的競爭性抑制因子，對未剪切的單剪切的HIV RNA的表達的穩(wěn)定性都有顯著的影響。將HIV Rev氨基酸序列中78位（L-D）和79位（E-L）進行定點誘變，則形成突變體Rev M10。此突變體保持了野生型Rev與Rev應答元件（RRE）結合的能力，卻沒有任何激活功能。以逆轉錄病毒載體-包裝細胞系基因轉移系統(tǒng)，將編碼Rev M10的基因導入到人T細胞系中以后，穩(wěn)定表達Rev M10的轉染細胞系可以顯著抵抗HIV-1的感染，并在人的外周血T淋巴細胞中得到重復。另外，將病毒基因特異性核酶的編碼基因導入到T細胞之中，也能使轉導的細胞產(chǎn)生針對這種病毒的細胞內免疫狀態(tài)。利用噬菌體展示技術篩選得到的肝炎病毒特異性單鏈可變區(qū)抗體可能是進行抗肝炎病毒細胞內免疫基因治療的重要研究方向。

 

　�。ㄆ撸�、誘餌設計

 

　　病毒基因的分子生物學研究為抗病毒基因治療提供了新的設計思路。如人免疫缺陷病毒（HIV）基因調控存在著極為復雜的順式和反工調節(jié)機制，這些調節(jié)機制已成為設計抗病毒基因治療方案的重要依據(jù)。HIV反式調節(jié)（trans regulation），即某些反式激活劑（transactivator）與HIV RNA的相應靶位結合，與HIV基因組復制和表達有著極為密切的關系。因此，可以設計一種基因，其轉錄物與HIV RNA競爭性地反式激話相結合，HIV RNA沒有足夠的反式激話劑的結合與刺激，就不能進行有效的復制和表達。與HIV RNA競爭性與反式激活劑引結合的RNA片段，稱為誘餌（decoy）分子。

 

　　誘餌RNA分子表達載體的設計和基因治療是抑制HIV復制和表達的重要策略。誘餌方案的設計和應用尋求病毒核酸與反式激活劑的分離，這就要求誘餌分子要處于量的優(yōu)勢。即必須處于"過表達（overexpression）"狀態(tài)。只有如此，才能有足夠的誘餌分子與HIV RNA競爭性地結合反式激活劑。針對HIV來說，誘餌設計最為常用的基因片段為Tat和Rev等。Gilboa等將HIV-1的Tat和Rev 的兩斷基因分別插入逆轉錄病毒載體，在內源性polⅢ（tRNAmet）啟動子系列的控制之下進行表達，可抑制CEM細胞中HIV的復制和表達。為了提高誘餌的表達水平及抗病毒作用，可將多個誘餌的編碼基因頭尾串聯(lián)在一起，這樣可提高表達的誘餌的分子數(shù)，提高其抗病毒的作用。

 

　　病毒基因的反式調節(jié)機制，不僅是設計抗病毒基因治療直接的理論根據(jù)，而且還為提高目的基因的表達水平提供了有效的手段。Bednarick等將人的IFN基因重組在HIV-1 LTR中的啟動子系列的下游，轉入Vero細胞以后，其分泌IFN的水平僅在50~150u/ml之間。如果向此表達系統(tǒng)中提供LTR中的啟動子的反試激活劑tst蛋白，受到反式激活以后，可使IFN的表達水平提高到103u/ml。目前基因治療研究領域中，基因的表達水平不高，妨礙了基因治療技術發(fā)揮更好的作用，這一機制是很有意義的。不僅細胞因子的表達水平可應用這一策略進行提高，誘餌分子的表達水平也同樣可以利用這一反式激活機制而得到提高。

 

　�。ò耍┎《靖腥炯毎�的自殺機制

 

　　抗病毒基因治療的研究，大多數(shù)情況下是根據(jù)病毒的分子生物學特點，依照細胞內免疫的原則進行設計的。這些方案的設計在很大的程度上依賴于包括蛋白質和RNA在內的感染因素的持續(xù)高水平的表達，這也是為什么細胞內免疫難以取得徹底治療效果的一個重要原因。因此，可以設計清除病毒感染細胞的基因治療方案，而不是單純干擾病毒的復制和表達過程。其中，自殺基因的導入及病毒感染細胞的清除的基因治療的策略在這一領域中占有重要地位。

 

　　引起細胞自殺的所謂"自殺基因（suicide gene）"種類很多，如某些病毒的基因，已知白喉毒素（DTA）在極低水平的情況下即可引起細胞發(fā)生死亡，促進藥物代謝和轉換的基因，如水痘-帶狀皰疹病毒（VSV）胸腺嘧啶核苷激酶（TK），可使無毒的丙氧鳥苷（GAN，ganciclovir）轉換為毒性極強的代謝產(chǎn)物，殺死細胞，HSV的TK基因也有類似的效果。另外還包括引起細胞程序化死亡（PCD,programmmed cell death）的基因等。

 

　　上述自殺基因的導入，可以有效地殺傷轉導的細胞是無疑的，但怎們保證細胞自殺的范圍僅限于病毒感染的細胞，而對于正常細胞無明顯副作用是設計是其關鍵。這種基因治療的方案也同樣可以利用病毒感染細胞的特點進行設計。法國的Klatzman等根據(jù)HIV及其感染細胞的特點設計了HIV感染細胞的自殺機制，以清除病毒感染的細胞，取得取較為滿意的治療效果。首先，將DTA基因重組到缺失突變型HIV LTR啟動子的下游，`如果細胞加沒有HIV的感染并提供反式激活蛋白，這種DTA就不會表達；但如果細胞感染了HIV，HIV的復制和表達過程同時為DTA的表達提供了的反式激活劑，經(jīng)刺激表達以后，可以引起HIV感染細胞的死亡。沒有感染HIV的細胞存在反式激活蛋白，DTA不表達，可以完好存活下來。利用這種機制就能選擇性地清除病毒感染的細胞。因此自殺機制也是抗毒基因的治療的一個重要組成部分。

 

　�。ň牛┓戳x核苷酸

 

　　反義核苷酸包括反義寡聚脫氧核糖核苷酸（ODN，oigodeoxynucleotide）和反義RNA兩種。反義RNA是在研究原核細胞基因調控中發(fā)現(xiàn)的一種負性調節(jié)因素。但后來證明，真核細胞的基因調控中也有反義RNA的參與。認為反義RNA分子在基因表達的調控中具有普遍 的意義。反義RNA與其序列互補的靶RNA以堿基酸對方式結合。阻斷基細胞內的轉運，剪切加工，與核糖體的結合。而且激活內源性的核核酶（如RNaseH等）將其分解。以抑制或阻斷某一基因的表達和功能。這一基因表達調控的機制，很快也應用了抗病毒基因治療的研究中。

 

　　Chatterjee 等應用腺相關病毒（AAV）載體構建了HIV RNA的反義RNA的表達載體，將這種重組表達載體導入到T淋巴細胞中，表達的反義RNA可與HIV LTR TARA 的一段63bp的序列補。這種反義RNA的表達，對HIV-1的抑制率達70-90%。反義RNA不僅在控制HIV-1感染中具有重要作用，而且在控制HBV，HSV人乳頭瘤病毒（HPV），勞氏肉瘤毒（RSV）等的感染中都有重要應用。

 

　�。ㄊ�）核酶

 

　　核酸（ribozyme）是一種具有酶的催化作用，能夠在GUC等特定的核苷酸序列的下游切割RNA分子的一類小RNA分子。核酸RNA分子的發(fā)現(xiàn)，打破了蛋白質在酶學領域中一統(tǒng)天下的局面，將酶的概念從蛋白質擴展到核酸領域。核酸RNA分子與底物RNA分子堿基酸對的方式進行結合，保證了核酶作用的高度特異性。同時，核核酸與底物結合形成的酶學活性中心，可對底物進行切割，破壞其結構。這樣，經(jīng)切割的RNA鏈再也不能作為翻譯蛋白質的模板，也不能作為逆轉錄的模板進行核酸的復制。核酶裂解物RNA高度特異性，高效裂解RNA底物的性質，作為抗病毒基因治療的新型分子，受到了廣泛的重視。認為核酸技術是抗病毒基因治療方案設計中重要探索方向。 核酸首先是在植物類病毒，衛(wèi)星病毒及某些原蟲，如四膜蟲（tetrahynena）等的研究中發(fā)現(xiàn)�？偨Y這些核酸RNA分子的基本結構，大致有錘頭狀（hannerhead motif）。發(fā)夾狀（hairpin motif）以及斧頭狀（axed motif）等結構類型。根據(jù)這些核酸基本結構類型，設計相對保守的活性中心結構，根據(jù)底物RNA鏈中裂解位點及其附件的核苷酸序列結構，設計核酶的側翼序列（flanking sequence）。從理論上來講，只要了解底物RNA 的系列及結構性質，就能設計出針對任何RNA分子的特異性核酶。核酶RNA分子中的側翼序列長謔只要保證在17nt以上，設計的核酶與底物RNA 分子結合的特異性，就會對人體細胞中正常的RNA發(fā)生列解反應。因為即使有一個核苷酸不能正確配對，活性中心就不能形成，列解反應就不會發(fā)生。

 

　　核酸的本質是RNA，從自然界中提取純化針對特異基歷片段的核酶RNA 分子是根本行不通的。人工RNA的合成是一條途徑，但價格昂貴。沒有實用前途。基因RNA制藥又沒有突破性的進展。因此，核酶的實際應用還需走基因治療的途徑。即體外設計核酶的編碼基因，以逆轉錄病毒載體導入到靶細胞中進行表達。這種基因治療的策略已經(jīng)過較為周密的細胞及動物水平的系統(tǒng)研究，美國已于1994年夏天開始抗HIV基因治療的I期臨床實驗。

 

　　1990年，Sarver等首次構建了HIV特異性核酶的重組表達載體，并在細胞內，細胞外成功地對HIV RNA進行了切割，以及抗HIV基因治療的實驗研究�？笻BV的核酶基因治療也順利進行。1992年，Chen等設計了9靶位的抗HIV核酶及Weizsacker等設計了3靶位抗HBV的核酶，使核酶的抗病毒技術日致成熟，成為抗病毒基因治療中又一重要的研究方向。想信核酶抗病毒基因治療途徑在未來的抗病毒基因治療研究中發(fā)揮更大的作用。

 

　　三、 病毒性肝炎的基因疫苗

 

　　將重組表達載體直接導入在體的器官和組織中，并獲得目的基因的表達，這在10余年之前就已實現(xiàn)，并作為某些基因治療方案中外源基因導入體內的一種方式而受到了廣泛的重視。但利用這一技術將一種誘導保護性免疫應答的抗原蛋白的重組表達載體導入體內，作為預防和治療傳染病的一種技術，不過是近幾年的事情。Ulmer等首先以流感病毒（influenza） 核殼蛋白（NP）的重組表達載體DNA接種健康小鼠，取得有效的體液與細胞免疫應答，并可以保護免疫動物不受多種流感病毒的感染攻擊，從而開創(chuàng)了基因疫苗防治傳染病的新時代。

 

　�。ㄒ唬� 基因疫苗的發(fā)展

 

　　流感病毒基因疫苗的研究開創(chuàng)了基因疫苗預防與治療傳染性疾病的新時代。流感病毒基因疫苗首先采用了高度保守的流感病毒核殼蛋白編碼基因，獲得了不同株流感病毒的交叉免疫保護作用。特別是后者又具有更為重要的實際應用價值。因為諸如人免疫缺陷病毒（HIV），丙型肝炎病毒（HCV）等病毒基因組存在著不同的基因型，而且在機體免疫選擇的壓力下還在繼續(xù)發(fā)生突變，如HCV的準種性就是一個典型的例子。對于流感病毒這種抗原多變性病毒基因疫苗研制的成功，其意義是廣泛而深刻的。

 

　　自1993年以流感病毒基因組構建基因疫苗表達載體而獲得成功以后，在短短在2年中，基因疫苗技術得到了迅猛的發(fā)展，不但從流感病毒擴展到HIV，HCV，乙型肝炎病毒（HBV）等病毒感染領域，還擴展到細菌，寄生蟲，支原體等其它的傳染病領域。不僅如此，抗腫瘤，自身免疫性疾病的基因疫苗研究也進展迅速。到1995年，抗腫瘤，抗HIV的基因疫苗在完成實驗室和動物模型研究并取得良好的結果的基礎上，已開始I期臨床試驗。這在一種生物學治療方法，從概念與技術路線的提出，到臨床I期試驗，是時間最短的一次�，F(xiàn)代生物學高技術發(fā)展速度之快，由此可見一斑。

 

　�。ǘ�） 傳染病基因疫苗研究概況

 

　　關于傳染病基因疫苗的研究，一方面尋找保護易感人群的有效免疫方法，同時基因疫苗又為難治性傳染病的治療提供了新的機遇。

 

　　1、 病毒感染性疾病的基因疫苗

 

　　HBV的基因疫苗研究，采用了乙肝病毒表面抗原（HBsAg）和乙肝病毒核心蛋白（HBcAg）的基因分別構建表達載體，或構建兩種蛋白的融合基因，都能誘導免疫接種小鼠出現(xiàn)特異性的體液和細胞免疫應答。HCV基因疫苗的研究主要集中在核殼蛋白以及非結構蛋白3（NS3）等編碼基因區(qū)，但也有少數(shù)研究采用了包膜區(qū)E1和E2區(qū)進行基因免疫。HIV基因疫苗則主要集中在HIV包膜糖蛋白的編碼基因區(qū)，如gp160,gp120和gp41等的編碼基因區(qū)。目前將HIV各種蛋白成份進行組裝，成為不含核酸成份的非感染性病毒蛋白顆粒，其免疫效果較單一的病毒蛋白成份要好得多。流感病毒基因疫苗除了采用抗原性多變的血凝素抗原（HA）編碼基因以外，還昆采用了高度保守的核衣殼蛋白（NP）的編碼基因，從而避開了流感病毒抗原漂變，不易制備具有普遍意義的預防疫苗的難點。另外，對于狂犬病毒（Rabies virus），單純皰疹病毒（HSV），人乳頭瘤病毒（HPV），淋巴細胞脈絡叢病毒（LMCV）的基因疫苗研究也取得了顯著的進展。

 

　　2、 細菌感染性傳染病的基因疫苗

 

　　針對細胞感染而設計的基因疫苗也取得了顯著的進展。結核桿菌感染目前在全球范圍內又呈上升的趨勢。卡介苗的接種其免疫效果也值得進一步研究，而且在很多國家沒有普遍進行卡介苗的預防接種。根據(jù)結核桿菌免疫的一些特點,設計了結核桿菌65kDa的熱休克蛋白（HSP65）的基因疫苗，可以誘導特異性的體液與細胞免疫應答，對于隨后接種的結核桿菌的感染具有顯著的抵抗能力。以HSP65基因疫苗免疫所誘導的免疫保護作用與接種活的卡介苗的免疫保護作用效果相似，但以HSP65蛋白作為亞單位疫苗進行免疫接種則無此免疫保護效果。同時，以來源于結核桿菌36kDa的富含脯氨酸的蛋白的編碼基因進行基因免疫，也能取得對結核桿菌感染的免疫保護作用。Huygen等應用結核桿菌抗原85（Ag85）的編碼基因進行基因免疫，也獲得了良好的免疫效果。

 

　�。ㄈ�） 病毒性肝炎基因疫苗研究的展望

 

　　傳染病基因疫苗的研究，首先要從傳染病病原體的分子生物學研究做起。到目前為止，為數(shù)不少的傳染病的病原體的基因結構及其編碼產(chǎn)物的性質還沒有弄清楚，這是妨礙傳染病基因疫苗研究的一個瓶頸。只有解決好這個前提，才能選擇好基因疫苗的目的的基因。

 

　　傳染病基因疫苗的研究，還要研究各種病原體抗原成份免疫應答的機制。許多研究已證明，并不是所有病原體的基因片段構建成的基因疫苗都能夠誘導保護性的免疫應答，而且每一種基因疫苗的免疫應答能力也是千差萬別的�；�因疫苗能夠誘導以細胞免疫為主的保護性免疫免疫應答是其區(qū)別于滅活疫苗與亞單位疫苗的重要標志，也是普遍認為基因疫苗為難治性傳染病治療方法最有前景的基本依據(jù)。但基因疫苗及其免疫應答的機制的研究還不系統(tǒng)。

 

　　傳染病基因疫苗的研究，其生命力還在于新型基因疫苗的研制。如慢性乙肝病人血清中有高滴度的乙肝病毒表面抗原（HBsAg），但機體多已發(fā)展為對HBsAg的免疫耐受。盡管研究表明基因免疫因其抗原的加工與提呈的路徑不同，從而產(chǎn)生與蛋白抗原不同的免疫效果，但以HBsAg的基因疫苗進行免疫接種時能否有效治療慢性乙型肝炎還不一定。因為目前的研究大部分集中在正常動物的免疫應答上，但慢性乙肝病菌對HBsAg的應答已經(jīng)發(fā)生了根本的變化，不能僅僅根據(jù)正常動物的免疫應答情況，推測慢性病毒感染個體的免疫應答。抗獨特型基因疫苗恐怕是解決這一問題的有效途徑。設計單一T細胞表位的基因疫苗也是較好的選擇之一。在某些情況下設計針對不合適的原位點的免疫應答，反而促進病原體免疫逃逸株的形成或加重感染的程度。因此，采用針對單一T細胞位點的基因疫苗免疫策略更為有利�；�因疫苗的研究還不得不重視抗原加工和抗原提呈方面輔助因子的功能。在某些情況下，可能是因為缺乏強免疫原的刺激，但也可能是因為抗原加工和提呈的輔助信號出現(xiàn)障礙，最終不能誘導有效的免疫應答。此時僅考慮病原體的抗原性是遠遠不夠的，免疫應答的輔助刺激信號也具有同等重要的地位。隨著這些技術環(huán)節(jié)的進一步解決，相信基因疫苗將是率先用于臨床傳染病治療的一種基因治療手段。