特異性T細胞擴增及干擾素γ產生的研究

【摘要】  目的  檢測重癥患者外周血中藥物特異性T細胞擴增及干擾素γ（IFN-γ）產生情況。  方法  共收集10例重癥藥疹門患者，分離患者外周血單一核細胞（PBMC），經相應的致敏藥物刺激后培養出T細胞株，用體外ELISpot和培養ELISpot方法檢測患者PBMC及藥物特異性T細胞株分泌IFN-γ的情況。對10例患者同時設立與致敏藥物分子結構不同的無關藥物對照組。結果 重癥藥疹組中德10例患者PBMC、藥物特異性T細胞株經致敏藥物刺激后，IFN-γ的分泌明顯高于正常對照組（P<0.01），且T細胞株經藥物刺激后IFN-γ的分泌顯著高于PBMC組（P<0.01）。與致敏藥物分子結構不同的無關對照藥物不能夠使藥疹患者PBMC產生IFN-γ，不能培養出相應的T細胞。3例重癥藥疹患者治愈1~3年后，PBMC中仍存在藥物特異性T細胞。結論 重癥藥疹患者體內存在藥物特異性T細胞。體外ELISpot聯合培養ELISpot方法在體外檢測可能有助于致敏藥物的鑒定。藥疹患者治愈后體內持續存在藥物特異性T細胞。
【關鍵詞】 藥疹；T淋巴細胞；干擾素Ⅱ型

藥疹是由藥物引起的不良反應，種類繁多，Stevens-Johnson綜合征（Stevens-Johnson syndrome，SJS）、大皰性表皮壞死松解型藥疹（toxic epidermal ecrolysis ,TEN）是藥疹中嚴重的兩種類型，常伴有大面值表皮剝脫，具有較高的死亡率。起病較急，癥狀較重，常伴有發熱、心、肺、肝、腎等內臟損害，甚至導致死亡。在對重癥藥疹的研究中相繼發現，SJS與TEN患者在首次發生藥物過敏反應之后，再次接觸只敏藥物反應迅速、強烈，對患者機體的損傷也更為嚴重。HLA基因在決定患者是否罹患重癥藥疹中具有重要作用。HLA-B*1502與卡馬西平、HLA-B*1502與別嘌醇導致的重癥藥疹相關。重癥藥疹患者皮損、水皰內含有HLA限制性、具有細胞毒活性的CD8﹢T細胞。應用藥物及其衍生物，可從患者外周血單一核細胞（PBMC）中培養獲得藥物特異性T細胞株和T細胞克隆。上述結果證實，免疫學機制在SJS、TEN發病中具有關鍵作用。大多數發疹型藥疹的發病屬于Th1反應優勢，重癥藥疹患者外周血T細胞受致敏藥物刺激后，Th1釋放IFN-γ增加，國內外也均由采用ELISA法、ELISpot方法體外檢測IFN-γ來判斷藥物特異性T細胞。為進一步了解其在重癥藥疹發病中的作用，我們分離獲得了重癥藥疹患者好轉后的PBMC，并采用體外ELISpot和培養ELISpot方法觀察藥物特異性T細胞。

對象與方法

1.檢測對象：重癥藥疹組10例，為2005年9月至2009年7月在本院皮膚科病房確診為SJS、TEN的患者、其中SJS6例，女4例，男2例；TEN4例，女2例，男2例；年齡3-80歲，平均年齡36歲，病史1周至3年；可明確致敏藥物4例，可疑致敏藥物2種5例，3種1例；可疑致敏藥物為阿莫西林5例，尼美舒利2例，硫酸羥氯喹2例，另外，頭孢唑林鈉、地爾硫卓、卡馬西平、安乃近、鹽酸地爾硫卓，對乙酰氨基酚、青霉素、別嘌醇各1例。正常人對照組10例，均為本實驗室工作人員，女6例，男4例。其他類型藥疹組10例，男4例，女6例；其中紅皮病型3例，多形紅斑性2例，紫癜型3例，蕁麻疹型2例；可明確致敏藥物3例，可疑致敏藥物2種7例。其中可疑致敏藥物為阿莫西林4例，尼美舒利，硫酸羥氯喹、頭孢唑林鈉，卡馬西平、對乙酰氨基酚各2例，地爾硫卓、安乃近、鹽酸地爾硫卓、青霉素、別嘌醇各1例。三組年齡差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

2.致敏藥物：根據患者病史，結合SJS和TEN常見致敏藥物的類型，初步判斷出致敏藥物。在應用致敏藥物研究的同時，對部分患者設立分子結構不同的無關藥物對照組。

3.主要試劑：人淋巴細胞分離液購自天津津脈基因測繪技術有限公司，ELISpot人IFN-γ試劑盒購自瑞典Mabtech公司；ELISpot96孔板購自美國Millipore公司；植物血凝素（PHA）購自美國Sigma公司。

4.血樣采集與處理：抽取患者及正常人20ml外周血，肝素抗凝，加入淋巴細胞分離液后梯度離心（20°C，2000 r/min,20 min），分離出PBMC，并用含10%胎牛血清的1640培養液將細胞數調至2×10⁶ 。各孔中分別加入可能致敏的藥物及無關對照藥物，設立不含藥物的空白對照組。孵育20h后，行ELISpot  IFN-γ檢測。
    實驗中致敏藥物的濃度按照患者治療濃度及此藥物的血藥濃度來推算，其實驗濃度如下：阿莫西林40 mg/L、頭孢唑林鈉50 mg/L、尼美舒利7 mg/L、硫酸羥氯喹40 mg/L、地爾硫卓150 mg/L、安乃近50 mg/L、別嘌醇50 mg/L、，其中尼美舒利選用尼美舒利分散片，硫酸羥氯喹、地爾硫卓。安乃近、鹽酸地爾硫卓均為成分藥（購自武漢遠城科技發展有限公司），將其溶于1640培養液后鈷60滅菌。文獻上已知可用的藥物濃度有：卡馬西平25 mg/L，對乙酰氨基酚50 mg/L。

5.藥物特異性T細胞株的培養：用含10%胎牛血清的1640培養液將PBMC調至2×10⁶ ，按每孔加入1.8ml加至24孔板中，在重癥藥疹組加入200µl相應得致敏藥物，空白組加200µl培養液。培養3 d換液時棄掉1 ml含IL-2（200IU/ml）的培養液，7 d 后行ELISpot IFN-γ檢測。

6.ELISpot 檢測IFN-γ：實驗分為重癥藥疹組、正常人對照組以及其他類型藥疹組，分離PBMC、藥物特異性T細胞，分別加至ELISpot培養板中，觀察致敏藥物刺激前后IFN-γ的分泌水平。同時每組內分別設置陰性對照（不加入任何刺激），陽性對照（加入PHA10µl，終濃度4 mg/L）。

7.統計學分析：采用方差分析和SNK-q 檢驗。P<0.05認為有統計學意義。

 

結果

1.體外ELISpot：10例重癥藥疹患者PBMC經致敏藥物刺激后IFN-γ的分泌均明顯高于對照藥物組、正常人對照組及其他類型藥疹組（P<0.01），但重癥藥疹患者加入非致敏藥物培養的PBMC，IFN-γ的分泌則于正常人對照組無明顯差異。10例其他類型藥疹中有4例PBMC經致敏藥物刺激后IFN-γ的分泌較對照藥物及正常人對照組升高（P<0.05）；而正常人PBMC加入與重癥藥疹患者相同的致敏藥物刺激前后的差異無統計學意義（P>0.05，見表1）。另外IFN-γ的分泌會隨著與致敏藥物共培養天數的增加而增多。

2.培養ELISpot：使用相應致敏藥物培養出藥物特異性T細胞株，并做ELISpot觀察，發現藥物特異性T細胞株經致敏藥物刺激后IFN-γ的分泌明顯高于正常人對照及其他類型藥疹組（P<0.01），而加入非致敏藥物培養的藥物特異性T細胞株，IFN-γ的分泌則于正常人對照組差異無統計學意義。10例其他類型藥疹中有4例T細胞株經致敏藥物刺激后IFN-γ的分泌較對照藥物組及正常人對照組有所升高（P<0.05）；而正常人加入與重癥藥疹患者相同的致敏藥物刺激前后的差異亦無統計學意義（P>0.05，見表1）。SNK-q檢驗分析結果顯示，PBMC、T細胞株兩組間IFN-γ的分泌差異有統計學意義（P>0.05），經藥物刺激后的T細胞株IFN-γ的分泌水平高于PBMC組。

3.藥物特異性T細胞的長期存在：3例病愈后1~3年的重癥藥疹患者，其PBMC及T細胞中均存在藥物特異性T細胞。提示至少在此期間內（3年），患者仍不能應用相關藥物，見圖1。

 

 

表1 藥疹患者PBMC及藥物特異性T細胞經致敏藥物刺激后IFN-γ的分泌情況（ x±s）

分組	例數	PBMC	特異性T細胞
正常人	10
刺激前		2.03±4.67	2.02±6.16
刺激后		2.40±5.45	1.96±6.17
其他類型藥疹	10
加對照藥物		2.13±4.90	2.02±5.66
加致敏藥物		36.35±3.71	82.72±85.58
重癥藥疹	10
加對照藥物		2.78±36.31	10.10±13.36
加致敏藥物		49.54±177.25	94.31±327.37

注：表中數據為患者PBMC、特異性T細胞經致敏藥物刺激后產生IFN-γ的細胞數（IFN-γ的數量/2×10⁶ ，單位：個）。重癥藥疹患者兩組間及與正常人組相比，差異均有統計學意義（P<0.01）；其他類型藥疹致敏藥物組與對照藥物組差異有統計學意義（P<0.05）

 

討論

我們應用體外ELISpot方法，觀察重癥藥疹患者外周血藥物特異性T細胞存在的情況。在所篩查的10例中，其外周血均存在相應的藥物特異性T細胞，并在相關藥物的刺激下殘生IFN-γ。并且，在相關藥物及IL-2存在的條件下，相應的T細胞可以得到選擇性擴增，能夠很好地培養獲得藥物特異性T細胞株，其產生IFN-γ的細胞明顯增加。我們的研究支持藥物特異性T細胞的活化和存在，可能是重癥藥疹發病的重要機制之一。在10例非重癥藥疹患者中的4例，我們同樣培養出可產生IFN-γ的藥物特異性T細胞株，這說明在有些非重癥藥疹患者體內，藥物特異性T細胞也可作為導致其發病的機制之一，或是說它有可能會進一步發展為重癥藥疹，這一結論與既往相關文獻報道一致，關于其作用機制我們將在以后的工作中進一步探索。

為了進一步了解該方法在檢測致敏藥物方面的可行性，在詳細追問患者用藥史，確認致敏藥物的同時，我們對10例重癥藥疹患者的PBMC加入分子結構不同的無關藥物，同時應用體外ELISpot和培養ELISpot方法，觀察患者PBMC對無關藥物的反應情況。結果證實，無關藥物不能夠使患者PBMC產生IFN-γ，也不能夠擴增患者的T細胞。本方法經反復試驗證實具有較高的穩定性，提示，體外ELISpot聯合培養ELISpot方法對體外檢測患者的致敏藥物具有潛在的應用價值。

在對長時間痊愈后的3例重癥藥疹患者的研究發現，藥物特異性T細胞能夠長時間存在于患者體內。通過對藥物刺激，其T細胞能夠得到選擇性擴增，并分泌IFN-γ。提示對于重癥藥疹患者，再次接觸致敏藥物仍有可能導致相應疾病的出現。因此，長時間的嚴格避免致敏藥物是必要的。我們的研究提示，從藥物特異性T細胞角度進一步研究其在重癥藥疹發病中德作用，觀察臨床治療用藥對藥物特異性T細胞的調控和干預作用，對深入揭示重癥藥疹發病機制和臨床藥物的治療機制具有重要意義。

  

參考文獻: 高揚,付萌，史曉蔚，廖文俊，高琳，高天文，王剛，李承新，劉玉峰， 重癥藥疹患者外周血藥物特異性T細胞擴增及干擾素γ產生的研究，中華皮膚科雜志2010年7月第43卷第7期

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