外陰鱗癌組織中HPV檢測(cè)及FHIT基因雜合性缺失、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性觀察

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【摘要】目的 觀察外陰鱗癌(VSCC)組織中HPV感染情況及脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因的雜合性缺失(LOH)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)，并探討其意義。方法 選取VSCC組織24例、外陰尖銳濕疣(VCA)42例、正常外陰組織20例，用PCR法檢測(cè)上述組織中的HPV6、11、16、18、31、33亞型，用PCR一單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析(PCR-SSCP)法檢測(cè)FHIT基因D3S1300位點(diǎn)的LOH和MSI。結(jié)果 在正常外陰、VCA、VSCC組織中低危型HPV(HPV6/11)陽(yáng)性分別為2、38、21例，高危型HPV(HPV16/18/31/33)陽(yáng)性分別為0、13、10例；VCA、VSCC組織與正常外陰組織比較，P均＜0.05。在正常外陰、VCA、VSCC組織中，FHIT基因D3S1300位點(diǎn)上LOH、MSI陽(yáng)性分別為0、9、13例，VSCC與VCA、正常外陰組織比較，P均＜0.05。VSCC組織中HR-HPV感染與FHIT基因D3S1300位點(diǎn)LOH/MSI相關(guān)(r=0.438，P＜0.05)。結(jié)論 VSCC組織中存在較高的低危型、高危型HPV復(fù)合感染及FHIT基因LOH和(或)MSI；二者在VSCC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

【關(guān)鍵詞】人乳頭瘤病毒；脆性組氨酸三聯(lián)體基因；雜合性缺失；微衛(wèi)星不穩(wěn)定性；外陰鱗癌；外陰尖銳濕疣

脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)基因是一種候選抑癌基因，惡性腫瘤及其癌前病變組織中常存在FHIT基因異常，如雜合性缺失(LOH)、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)等，與人乳頭瘤病毒(HPV)感染可能有關(guān)。高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)與宮頸癌和宮頸上皮內(nèi)瘤變有關(guān)，包括HPV 16、18、31、33、35、39、45、5l、52、56、58、59、68等亞型；低危型人乳頭病病毒(LR-HPV)與外生殖器尖銳濕疣等良性病變有關(guān)，包括HPV 6、11、42、43、44、54亞型等。2006~2010年，我們觀察了外陰鱗癌(VSCC)組織中HPV6、11、16、18、31、33基因型別感染情況及FHIT基因的LOH、MSI，探討二者在VSCC發(fā)展中的作用及相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2004~2008年經(jīng)病理確診的24例VSCC及42例外陰尖銳濕疣(VCA)患者的病變組織蠟塊，以外陰良性病變切除的正常外陰組織20例作為對(duì)照；試劑為dNTP、Taq酶；FHIT基因D3S1300位點(diǎn)引物核苷酸序列：F為5′-AGCTCA-CATTCTAGTCAGCCT-3′，R為5′-GCCAATrCCCCA-GATG-3′，產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為217~241 bp。HPV6、11、16、18、31、33亞型引物核苷酸序列，見(jiàn)表1，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 HPV感染與FHIT基因LOH、MSI檢測(cè)方法 用PCR法檢測(cè)HPV6、11、16、18、31、33亞型，用PCR-單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析(PCR-SSCP)法檢測(cè)FHIT基因D3S1300位點(diǎn)的LOH和MSI。采用標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿-異戊醇法抽提組織DNA，TE溶解后4℃保存?zhèn)溆谩?/span>PCR擴(kuò)增體系(25μL)：DNA模板100~200ng，引物各0.5 mmolfL，每種dNTP各200mol/L，Taq酶1 U。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；35個(gè)循環(huán)的94℃ 變性30s，53.6℃(D3S1300，HPV6、11為50.9℃，HPV16、18為52.3℃，HPV31、33為47.6℃)退火30s，72℃延伸30s；72℃再延伸5min。結(jié)束后經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)HPV擴(kuò)增產(chǎn)物的相應(yīng)長(zhǎng)度判斷亞型結(jié)果(HPV6、11、HPVl6、18、HPV31、33擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為263、144、471、268、448、462 bp)。取D3S1300擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，變性后于12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色并觀察結(jié)果。若病變組織比病變旁組織條帶增多、位置改變或濃度增加等記為MSI；若條帶消失或相對(duì)密度減少50%以上記為LOH。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較用χ²檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，相關(guān)性分析用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法。P40.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在正常外陰、VCA、VSCC組織中HR-HPV(HPV6/11)陽(yáng)性分別為2、38、21例，HR-HPV(HPV16/18/31/33)陽(yáng)性分別為為0、13、10例；VCA、VSCC組織與正常外陰組織比較，P均＜0.05。HPV的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳圖，見(jiàn)圖1。

在正常外陰、VCA、VSCC組織中，FHIT基因D3S1300位點(diǎn)上LOH、MSI陽(yáng)性分別0、9、13例；VSCC與VCA、正常外陰組織比較，P均＜0.05。FHIT基因D3S1300位點(diǎn)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增見(jiàn)圖2，PCR-SSCP電泳圖見(jiàn)圖3。

相關(guān)分析顯示，VSCC組織中HR-HPV感染與FHIT基因D3S1300位點(diǎn)LOH/MSI相關(guān)(r=0.438，P＜0.05)，LR-HPV與FHIT基因LOH/MSI不相關(guān)(r=0.158，P＜0.05)。VCA組織中LR-HPV及HR-HPV感染與FHIT基因LOH/MSI均不相關(guān)(r分別為0.169、0.027，P均＜0.05)。

3 討論

自從1996年發(fā)現(xiàn)FHIT基因以來(lái)，大量研究發(fā)現(xiàn)FHIT基因在頭頸部惡性腫瘤、肺癌、消化道惡性腫瘤、乳腺癌及宮頸癌等各類惡性腫瘤中存在廣泛異常，提示FHIT基因與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。惡性腫瘤及其癌前病變組織中FHIT基因的異常與HPV感染可能有關(guān)。

林云等研究發(fā)現(xiàn)，在VSCC中HPV16/18的感染率比正常對(duì)照組高，提示HPV感染可能在VSCC發(fā)生發(fā)展中起一定作用。本研究結(jié)果顯示，VSCC和VCA中均存在LR-HPV和HR-HPV的復(fù)合感染，且二者比較并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。目前，尚無(wú)證據(jù)表明HR-HPV感染與VSCC的發(fā)生相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，VSCC組織中FHIT基因D3S1300位點(diǎn)LOH、MSI陽(yáng)性率為54.2%，表明FHIT基因廣泛出現(xiàn)異常，與其他報(bào)道一致；VCA組織中也已出現(xiàn)FHIT的異常(陽(yáng)性率為21.4%)，但較VSCC低(P＜0.05)。這提示FHIT基因異常與VSCC發(fā)生可能相關(guān)，VCA可能是VSCC的前期病變，FHIT基因異常可能是VSCC癌前病變的分子標(biāo)志。D3S1300位點(diǎn)位于FHIT基因第1編碼外顯子(E5)附近，該位點(diǎn)出現(xiàn)高頻率的LOH和(或)MSI與FHIT基因異常轉(zhuǎn)錄本中E5的缺失相吻合，提示FHIT基因缺失在VSCC中較常見(jiàn)。

3p14.2、3p21被認(rèn)為是LOH集中發(fā)生的亞區(qū)域，而FHIT基因定位于3p14.2。有研究者認(rèn)為，HPV病毒可直接整合到FHIT基因脆性位點(diǎn)，引起染色體基因組的不穩(wěn)定，這可能是HR-HPV致癌的機(jī)制之一。Buher等研究發(fā)現(xiàn)，FHIT基因LOH與HPV16、31感染有顯著相關(guān)性；而有研究發(fā)現(xiàn)，FHIT基因突變與HPV感染無(wú)關(guān)，二者是參與宮頸癌發(fā)生的兩個(gè)獨(dú)立致病因素。本研究結(jié)果表明，在VSCC組織中FHIT基因LOH/MSI與HR-HPV感染有關(guān)，提示其感染可能是FHIT基因LOH和(或)MSI發(fā)生的因素。另外，本研究結(jié)果僅反映出FHIT基因片段的LOH和(或)MSI與VSCC的發(fā)生有關(guān)，不能證實(shí)其改變是癌前病變或早期診斷的分子標(biāo)志物，還是參與VSCC進(jìn)展的晚期事件，或作為判定患者預(yù)后的指標(biāo)。因此，還有必要擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步明確FHIT基因的異常在VSCC中的生物學(xué)作用以及與其他因素的關(guān)系。

(范余娟，蒙亞晴，外陰鱗癌組織中HPV檢測(cè)及FHIT基因雜合性缺失、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性觀察[J]山東醫(yī)藥2012年第52卷第2期：21-23)

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