鬼臼類植物產鬼臼毒素(疣迪搽劑)內生真菌的篩選

鬼臼類植物是小檗科(Berberidaceae)鬼臼亞科(Podophylloideae)桃兒七屬(Sinopodophyllum)、山荷葉屬(Diphylleia)、八角蓮屬(Dysosma)及足葉草屬(Podophyllum)植物的統稱。鬼臼類植物是一類含有顯著生物活性物質，又有悠久應用歷史的藥用植物，用于治療多種疾癥。1880年，Podwyssotzkii從美洲桃兒七(Podophyllum peltatum)的樹脂中分出了結晶性成分鬼臼毒素(podophyllotoxin)，后來證明鬼臼毒素具有顯著的抗癌活性；其衍生物鬼臼乙叉苷(VP₁₆)、鬼臼噻吩苷(VM₂₆)等已被美國FDA批準上市，用于治療多種癌癥。目前鬼臼毒素主要從鬼臼類植物根、莖中提取，過度采挖致使植物資源遭到嚴重破壞；44學合成鬼臼毒素的難度大，成本高，全合成不經濟；植物組培雖取得了一定進展，但還無法實現大規模工業化生產。1993年，Strobel等從短葉紅豆杉(Taxus brevifolia)樹皮中分到一株產紫杉醇的內生真菌安德氏紫杉霉(Tax-omyces andreanae)，因而開始了利用植物內生真菌發酵生產抗癌活性成分新途徑的研究。為此，我們開展了對桃兒七、南方山荷葉、川八角蓮等植物內生真菌的研究，現報道其中部分工作結果。

1 材料和方法

1.1 材料

桃兒七(Sinopoclophyllum hexandrum)、南方山荷葉(Diphylleia sinensis)采自云南省中甸縣，川八角蓮(Dysosma z~itchii)采自云南省蒿明縣。鬼臼毒素標準品購自Sigma公司。

1.2 培養基

馬鈴薯葡萄糖培養基(m A)、查氏培養基、促孢培養基、改良基礎液體培養基(MM)。

1.3 內生真菌的分離和純化

植物樣品采集后立即處理。取三種植物地下莖，按下列程序表面消毒：自來水沖洗干凈—町5％酒精漂洗(3～5min)一無菌水沖洗3～4次。1％升汞漂洗(10～30s)一無菌水沖洗5次。將上述處理過的莖在無菌條件下切割成約0.5crn×0.5 era的小片(取韌皮部)，然后將小片種植于PDA平皿上，置于28℃溫箱培養3～7 d后，即可見樣品切割過的邊緣長出菌絲，經純化后轉移到PDA斜面上備用。

為檢查表面消毒是否徹底，做了對照實驗。將上述同樣條件處理過的莖段不作切割直接種植于PDA平皿上，置于相同條件下培養，結果對照用的莖段周圍無任何菌長出，多次重復如此，證明所分到的菌是韌皮部內的，而不是表面的附生菌。

1.4 產鬼臼毒素菌株的篩選

1.4.1 內生真茵的液體培養將100 ml改良MM液體培養基裝于250 ml三角瓶中，每個菌號裝5瓶，共500 ml的量，滅菌，挑適量菌絲或孢子接種于三角瓶中，于28℃搖床(110 r／min)培養7～10 d。進行提取。

1.4.2 提取方法發酵液500 rnl一過濾一濾液(菌絲冷凍數十分鐘，搗碎，加入濾液) Ⅱ等體積氯仿，萃取過夜一取氯仿層蒸餾濃縮一置干凈青霉素小瓶中備用。

1.4.3 TLC分析硅膠G板購自青島海洋化工廠。兩種展開劑為氯仿：甲醇(95：5 v／v)；氯仿：乙酸乙酯(8：2 v／v)。濃硫酸一乙醇(1：1 v／v))顯色(120℃，5 min)。

1.4.4 HPLC檢測Waters 201型HPLC儀；檢測器 81。HPLC條件：柱系Bondapak C-18 10 300×3.9 mm(i.d)；流動相CHaCN：H20=50：50(v／v)；流速1.0 ml／min；檢測波長UV254 rim；進樣量10。

2 結果與分析

2.1 內生真菌的分離

從上述三種植物中共分得內生真菌92株，其中從桃兒七分得內生真菌28株，占總分離菌株數的3096；南方山荷葉內生真菌35株，占總分離菌株數的38％；川八角蓮內生真菌29株，占總分離菌株數的3296。僅從三種植物地下莖韌皮部就分離出92株內生真菌，充分顯示出植物內生真菌資源的豐富。叢梗孢屬、青霉屬為三種植物內生真菌共有的優勢屬，而無孢菌群、曲霉屬、毛殼菌屬、擬青霉屬為三種植物內生真菌常見屬，其余為偶見。這說明三種植物內生真菌有一定共性，但植物種類不同，生境不同，內生真菌也存在著較大差異。

2.2 產鬼日毒素菌株的篩選

經TLC初步分析表明，在92株內生真菌中，共有8株菌的液體發酵提取物出現了與標準品遷移率(Rf)相同的斑點，它們可能產鬼臼毒素。為了證實它們是否確能產鬼臼毒素，采用HPLC對它們的發酵提取物進行了分析檢測，結果表明，其中2株不產鬼臼毒素，其余6株能產鬼臼毒素，占總分離菌株數的6.596，其中桃兒七產鬼臼毒素內生真菌2株，占分離自該植物內生真菌總數的7％；南方山荷葉產鬼臼毒素內生真菌1株，占分離自該植物內生真菌總數的3％ ；川八角蓮產鬼臼毒素內生真菌3株，占分離自該植物內生真菌總數的10％。這也表明植物內生真菌中存在著豐富的產抗癌活性成分的真菌資源。

2.3 產鬼臼毒素菌株屬的分布

從三種植物分離的產鬼臼毒素內生真菌分布在青霉屬(Penicillium)等4個屬中。其中青霉屬為三種植物產鬼臼毒素內生真菌的共有屬，但種不同。從桃兒七分離的是點青霉(P.notaztum)，從南方山荷葉分離的是糾錯青霉(P.implicatum)，從川八.角蓮分離的是產紫青霉(P.purpurogenum o這說明，產鬼臼毒素內生真菌資源具有豐富的多樣性。

3 討論

植物內生真菌，是指生活在植物體內或在其生活史的一定階段處于植物體內的一類真菌，被感染的宿主植物(至少是暫時)不表現出外在病癥，可通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內直接擴增出微生物DNA的方法來證明其內生。這類菌涵蓋面相當廣，包括菌根真菌和植物病原真菌在內。也有一些研究者認為內生真菌是指存在于健康植物莖葉中，形成不明顯侵染的一類真菌。植物內生真菌在植物微生態系統中，長期與宿主建立了和諧的協同關系，其次生代謝產物十分豐富，具有多種生物活性n 3l。有的內生真菌與宿主植物只形成不太明顯的共生或伴生關系，有的對宿主體內某些活性成分的形成產生重要影響，而有的則能產生與宿主相同或相似的生理活性成分。

通過研究，我們發現植物內生真菌資源十分豐富。植物種屬不同，生境不同，內生真菌存在較大差異。某些植物內生真菌能產生與宿主植物相同或相似的抗癌活性成分是抗癌藥物研究和開發的重要資源。同時，植物內生真菌的生境特殊性決定了其既有理論研究的深遠意義，又有多方面的應用潛力，是人類亟待保護和開發利用的寶貴資源。在植物內生真菌研究中，還應重視以下問題：

(1)采樣季節不同，同一地點同一植株的同一部位分到的內生真菌也存在一定差別，這可能是由于植物內生菌有的能長久存在于植物組織內，有的則只在整個生活史中存在一段時間所致。

(2)采用的研究方法和手段不同，也會造成對植物內生真菌分離準確性的影響。目前對植物內生真菌種類數量的估計依賴于培養基，用哪些培養基才能反映內生真菌在宿主組織中的真實種群及數量，尚需探討。另外，在自然條件下，微生物本來是混居的，并非單獨存在。不少微生物至今難以人工培養、檢測，許多微生物只有混合培養時才能生長，而在純培養時就不能生長。因此，內生真菌的分析研究有待深人，在方法手段上也有待改進。

(3)植物內生真菌的遺傳穩定性是值得深人探討的問題。所分離到的菌株，在1~3代時可保持產宿主某些活性成分(抗癌物質等)的特性，而多次轉接后往往減弱，甚至消失這種特性，其中原因待查，尤其涉及到與宿主的協同進化關系和生態條件等。

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