干擾素-γ基因修飾肝細胞治療血吸蟲病肝纖維化實驗研

　　目的：探討γ-干擾素(IFN-γ)基因修飾的肝細胞經脾移植抗血吸蟲病肝纖維化作用。

　　方法：采用ELISA和免疫組化方法，動態分析日本血吸蟲感染小鼠IFN-γ和Ⅰ、Ⅲ型膠原水平及其相互關系，并將小鼠IFN-γ重組腺病毒轉染的肝細胞經脾移植到感染16周小鼠，分析IFN-γ基因治療血吸蟲病肝纖維化的作用。

　　結果：感染4周時，小鼠IFN-γ水平明顯升高，在感染12周時達高峰;但在16周以后IFN-γ水平明顯下降，而Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成持續增高;IFN-γ基因修飾的肝細胞經脾移植后能穩定有效地表達，顯著降低Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成、沉積，減輕肝纖維化程度。

　　結論：IFN-γ可能與Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成、沉積有關;IFN-γ基因治療能有效地發揮抗血吸蟲病肝纖維化作用。

　　γ-干擾素(IFN-γ)是目前已知有確切抗肝纖維化作用的細胞因子。實驗表明能明顯抑制感染血吸蟲小鼠貯脂細胞激活，減少膠原的合成[1]。晚期血吸蟲病患者通常都有免疫功能低下，其血清IFN-γ水平明顯低于正常人。動物實驗和臨床應用IFN-γ治療血吸蟲病肝纖維化和肝炎后肝纖維化均取得明顯的效果[2]。但體內影響IFN-γ藥效因素很多，如半衰期短、抗體的產生，與靶器官以外的器官、組織、細胞受體結合，大劑量應用有明顯的毒副作用等。實驗表明，脾內移植肝細胞能定向分布于肝臟，并同化入肝實質中存活，有效地表達外源基因[3]，我們在分析血吸蟲感染小鼠IFN-γ動態變化及其與膠原合成關系的基礎上，將IFN-γ基因修飾的肝細胞經脾移植，探討抗血吸蟲病肝纖維化的作用。

　　材料與方法

　　一、實驗材料

　　BALB/c小鼠，6～8周齡，雄性，購自上海必凱實驗動物公司;小鼠正常胚胎肝細胞株BNL·CL2細胞購自美國ATCC;表達小鼠IFN-γ基因的重組腺病毒Ad-ex1 CA-mIFN(IFN-γ/Ad)，表達LacZ基因的重組腺病毒Ad-ex1 CA-RXZ(LacZ/Ad)由日本癌癥研究會分子生物治療研究部Hamada博士惠贈;mIFN-γ ELISA檢測試劑盒，抗小鼠IFN-γ、Ⅰ、Ⅲ型膠原單抗均購自Endogen公司;SABC試劑盒購自武漢博士德公司。

　　二、血吸蟲病肝纖維化模型

　　80只BALB/c小鼠隨機分為正常對照、感染和治療組。除正常對照外，其余皮下感染日本血吸蟲尾蚴25條。感染組分別在感染后4、8、12、16、20、24周解剖;治療組在感染16周作肝細胞脾內移植。取各實驗組部分肝組織用10%福爾馬林固定，制成4μm厚石蠟切片，作免疫組化;同時取血清，-20℃保存，待檢。

　　三、肝細胞體外基因修飾

　　取對數生長期BNL·CL2細胞，經Hanks液洗2遍后，用無血清RPMI-1640調至1×106/ml，加至24孔板中，每孔1ml，待細胞貼壁后棄上清，按重復感染度(MOI)為1∶100加入病毒稀釋液0.5ml，37℃5%CO2溫箱中溫育30分鐘，洗去殘留病毒液，補充RPMI-1640 1ml，37℃5%CO2溫箱中溫育，每隔4小時收集培養上清，-20℃保存待檢。

　　四、肝細胞脾內移植

　　治療組在感染后16周作肝細胞脾內移植。收集對數生長期的肝細胞，經Hanks液洗2遍后配成1×107/ml備用。乙醚麻醉小鼠，局部消毒后，于左肋下做1cm左右切口，暴露脾臟，脾內注射肝細胞0.2ml(2×106細胞/只)，設BNL·IFN-γ治療組、BNL·LacZ病毒對照組、BNL·CL2細胞對照組三個亞組，在移植后第4、8周解剖。

　　五、培養上清和血清IFN-γ水平檢測

　　按Endogen公司產品說明書，用ELISA法檢測培養上清和血清中的IFN-γ水平。

　　六、肝組織內IFN-γ、Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的檢測

　　采用SABC法，一抗為抗小鼠IFN-γ、Ⅰ、Ⅲ型膠原單抗，二抗為生物素化羊抗鼠IgG，繼用SABC復合物，DAB顯色，脫水、透明、封片后，用圖像分析儀MIPS作陽性分布面積半定量分析。

　　七、統計學處理

　　組間均數比較采用雙側t檢驗。

　　結　　果

　　一、重組腺病毒轉染BNL·CL2細胞培養上清IFN-γ水平檢測

　　mIFN-γ重組腺病毒轉染4小時即可在培養上清檢測到IFN-γ(5.64±2.16)ng/ml，24小時時達高峰(60.54±16.42)ng/ml，而轉染LacZ基因的病毒對照和未轉染的細胞對照未檢測到IFN-γ。轉染后14天，培養上清中仍可檢測到IFN-γ(36.22±8.64)ng/ml，說明mIFN-γ重組腺病毒能有效地轉染IFN-γ基因到肝細胞穩定表達。

　　二、感染小鼠血清IFN-γ的動態變化

　　正常小鼠血清IFN-γ含量僅(2.94±0.96)ng/ml，感染4周時血清中可檢測到較高水平的IFN-γ(15.62±3.00)ng/ml，8周時為(21.66±3.72)ng/ml，12周時達高峰(28.92±3.86)ng/ml，隨后明顯下降，感染16周時降至(17.84±2.41)ng/ml，20周時為(14.32±2.73)ng/ml，24周時為(7.52±2.73)ng/ml。正常對照、感染后4、12、16、24周組間比較差異均有顯著性(P<0.01)。

　　三、感染小鼠肝內IFN-γ、Ⅰ、Ⅲ型膠原的動態變化

　　正常小鼠肝內IFN-γ散在分布肝竇壁附近，量稀少。感染4周時蟲卵肉芽腫開始形成伴炎癥反應，IFN-γ表達開始增加，隨蟲卵肉芽腫炎癥加重，IFN-γ含量也明顯增多，感染12周時達高峰，明顯多于感染后4、8周時水平(P<0.01)，主要分布在蟲卵肉芽腫周圍和肝竇壁。感染后16周蟲卵肉芽腫成熟，炎癥減輕，IFN-γ表達明顯減少，與12周時相比差異也有顯著性(P<0.01)。同時可見，隨著感染時間的延長，Ⅰ、Ⅲ型膠原含量逐漸增多，并由感染初期的細線狀逐漸增厚變寬，呈條索狀或網狀分布在蟲卵肉芽腫和匯管區周圍。見表1。

　　四、肝細胞移植后血清IFN-γ水平

　　移植后第4周，BNL·IFN-γ治療組血清可見高水平的IFN-γ(81.54±11.19)ng/ml，與移植BNL·LacZ基因的病毒對照組(28.62±6.15)ng/ml和BNL·CL2細胞對照組(20.30±4.61)ng/ml比較差異有顯著性(P<0.01);并且在移植后第8周，BNL·IFN-γ治療組仍可測到高水平的IFN-γ(70.42±14.67)ng/ml，與移植后第4周時相比差異無顯著性(P>0.05)�？梢姡�移植后第8周仍有高效表達。

　　五、肝細胞移植后對肝內膠原合成的影響

　　移植后第4周，BNL·IFN-γ治療組肝內可見許多散在集落狀IFN-γ著色陽性細胞，蟲卵肉芽腫周圍也有明顯的IFN-γ表達，與同期單純感染組、病毒對照組、細胞對照組相比，差異均有顯著性(P<0.01)。同時可見，BNL·IFN-γ組肝內Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯減少，與同期感染組、病毒對照組和細胞對照組比較差異均有顯著性(P<0.01);而感染組、細胞對照組和病毒對照組組間比較差異無顯著性(P>0.05)。

　　討　　論

　　血吸蟲病肝纖維化主要與蟲卵肉芽腫及其某些細胞因子有關，其中IFN-γ既影響蟲卵肉芽腫的形成，又抑制貯脂細胞的激活，減少膠原的合成[1，2]。本研究結果表明感染早期隨著蟲卵肉芽腫形成和炎癥反應加重，血清和肝內IFN-γ水平均顯著增加，這可能與較多的淋巴細胞浸潤并釋放IFN-γ有關。而在蟲卵肉芽腫成熟，炎癥反應減輕時，血清及肝內IFN-γ水平均明顯減低。提示在感染早期IFN-γ作為炎癥因子與蟲卵肉芽腫形成有關，而在后期與膠原纖維的合成沉積相關。

　　根據感染過程IFN-γ與Ⅰ、Ⅲ型膠原表達的關系，我們在感染后16周，即蟲卵肉芽腫成熟，IFN-γ水平降低，而Ⅰ、Ⅲ型膠原表達明顯增加時，將IFN-γ基因修飾的肝細胞經脾移植，分析其抗血吸蟲病肝纖維化作用。結果表明，移植后第4周，BNL·IFN-γ治療組血清和肝內IFN-γ表達水平均有顯著增高，與同期(感染20周)的感染組、病毒對照組和細胞對照組比較，差異均有顯著性，網狀結構消失，纖維條索變細減弱。移植后第8周，BNL·IFN-γ治療組仍有IFN-γ的高效表達，肝纖維化程度進一步減輕，可見有明顯的抗肝纖維化作用。至于IFN-γ是如何發揮抗肝纖維化作用，除直接抑制貯脂細胞激活、增殖、合成細胞外基質外[1，4]，可能是通過抑制其它細胞因子而影響肝臟細胞外基質的沉積[5]，值得進一步研究。

　　肝臟靶向性基因治療是目前基因治療的研究熱點之一，曹雪濤等[6]將白細胞介素-2基因修飾的肝細胞脾內移植到荷瘤小鼠，能明顯增強小鼠肝臟抗腫瘤免疫功能。本研究結果表明，將IFN-γ基因修飾的肝細胞脾內移植后，即移行到靶器官肝臟，穩定地表達IFN-γ，抑制肝內膠原的合成，從而達到抗肝纖維化作用。為基因治療血吸蟲病肝纖維化作了積極的探索，并為重型肝炎、肝癌及遺傳性肝病的基因治療提供了理論依據。

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