抗癌新藥β-欖香烯的研究及展望

    到目前為止，關于β-欖香烯研究的論文近千篇，內容涉及原料來源、分離鑒定、含量測定方法、藥理藥效、制劑、結構改造、作用機制和臨床應用等方面。表明我國醫藥工作者和研究人員對具有獨立知識產權的抗癌新藥有著濃厚興趣。

    然而，有相當一部分論文，特別是1996年以前的研究論文，β-欖香烯與欖香烯混淆的現象較嚴重，給檢索文獻和查新工作帶來了許多混亂和誤解。本文在展示β-欖香烯的研究軌跡的同時，對β-欖香烯與欖香烯的關系進行簡述。

1 β-欖香烯的由來

    β-欖香烯是從植物中提取的倍半萜烯類化合物，是文獻中的已知化合物。據報道含β-欖香烯的植物有40多種，其中含量在1%以上的有10多種，如天女木蘭油、蟹橙葉油、金彈葉油、羅紋葉油、羅浮葉油、樹蘭花油、石南藤油等。

    早在1957年，研究人員從土木香油中提取了β-欖香烯并進行了結構鑒定。1981年, β-欖香烯具抗癌活性被我們課題組首先發現并進行了報導。通過“七五”、“八五”、“九五”國家科技攻關計劃等一系列研究，取得可喜的成果。

2 β-欖香烯的分離與鑒定

    研究發現，含β-欖香烯的揮發油很多，但大部分揮發油類是香料，價格高，含量低。天女木蘭油含量最高（27%），色譜峰附近的峰也較少，較適合提取β-欖香烯，但這種油產量少、價格高、多售往國 外，用于提取β-欖香烯的原料成本太高，不宜作生產原料。近幾年關于人參和三七中含有揮發油的報道很多，可它們不僅是貴稀藥材，且含β-欖香烯量很低，也不適宜作提取β-欖香烯的原料。

    后來發現香料化工廠用香茅油提取香精后的油角含β-欖香烯較高，成本低，產量也高，是一種理想的提取β-欖香烯原料。

    揮發油多由萜類、倍半萜類等主要成分組成，含β-欖香烯的揮發油往往與一些結構相似的倍半萜類或它的同分異構體類物質混雜在一起。特別是溫莪術揮發油中有100多種成分：有倍半萜類化合物、有多種β-欖香烯的同分異構體，它們的臨界溫度或分子運動平均自由程相相差無幾，所以僅用一種方法難以得到β-欖香烯單體。

    特別是不同來源的原料，所含成分與含量往往還略有不同。所以必須通過精密分餾、分子蒸餾或超臨界二氧化碳法進行初分，然后再通過薄層法尋找最佳分離條件進行柱層析，一次分不開還要進行二、三次。這樣才能得到β-欖香烯單體。

    筆者以香茅草油提取其他香精后的油角為原料，用自行改進的精密分餾裝置，一般需進行2～3次分餾。然后用大容量高壓色譜制備柱（一次進樣100g），用石油醚洗脫，收取純度98%以上的β-欖香烯。大連遠大制藥有限公司用這種方法為藥品生物制品檢定所制備了我國第一批β-欖香烯對照品。現已對外供應。

    取純度為99.52%的β-欖香烯，通過元素分析和質譜測定表明β-欖香烯由C、H組成，符合C₁₂H₂₄分子式（見圖1）。紅外光譜測定提供化合物中有下列基團：CH₃、CH₂、R₂C=CH₂、C=C；1HNMR譜、13CNMR譜、HMBC譜、DEPT譜和HSQC譜等提供的信息給出化合物中碳和氫的準確歸屬。

    高分辨質譜測定得到了β-欖香烯結構的合理解析。所測得的圖譜均與文獻報道的圖譜一致。
3 β-欖香烯的藥效及作用機制
    雖然β-欖香烯的抗腫瘤作用早已被臨床和實驗證實,但其抗腫瘤譜則隨著研究的逐步深入而逐漸擴大，β-欖香烯的其他方面作用也不斷被證實，近年來許多人還對β-欖香烯的作用機制也進行了多方面的探討。

    研究發現，β-欖香烯明顯降低BIU-87細胞膜脂流動性，抑制BIU-87細胞磷脂代謝、Bcl-2表達及膜脂流動性，影響BIU-87細胞內鈣穩態，細胞的變化主要發生在細胞核。β-欖香烯對2-乙酰氨基芴誘發實驗性鼠肝癌有一定阻抑作用，對四氯化碳肝纖維化大鼠具有拮抗作用，主要是通過抑制肝星狀細胞激活，降低TGF-β1、α-SMA在肝組織中的表達，減少細胞外基質在肝臟中的沉積，從而延緩肝纖維化的進程。

    β-欖香烯可顯著抑制B16細胞對纖維結合蛋白和層粘連蛋白兩種基質的粘附，抑制B16細胞的運動，延遲吸管尖部所致細胞單層損傷的愈合，提示β-欖香烯對B16細胞粘附和運動能力的抑制可能是其抗腫瘤轉移作用的機制之一。用改進的機械分散法制備β-欖香烯修飾脂質體瘤苗，并通過腹腔接種將脂質體包裹的H22抗原免疫荷瘤小鼠，發現β-欖香烯可增強脂質體瘤苗的抗肝癌免疫效應。

    用Annexln-V-F1TC標記后FCM分析細胞早期凋亡，結果β-欖香烯誘導小鼠肝癌細胞早期凋亡呈劑量依賴性。β-欖香烯可使人乳腺癌MCF-7／ADM細胞對阿霉素（ADM）的耐藥性明顯逆轉，逆轉機制與增加細胞內藥物積累及降低Bcl-2的表達有關。

    通過激光共聚焦掃描顯微鏡實時觀察發現β-欖香烯使 HcaF細胞內游離鈣離子水平先升后降，推測β-欖香烯誘導的腫瘤細胞凋亡可能是鈣依賴性的。β-欖香烯可使K562細胞株端粒酶活性下降，下降程度呈濃度、時間依賴性，抑制端粒酶活性后，K562細胞的端粒長度略有延長。β-欖香烯聯合IL-23轉染樹突細胞（DC）疫苗組腫瘤生長受到顯著抑制，說明β-欖香烯有一定的協同抗癌作用。

    采用烯丙位的氯代反應，先合成β-欖香烯氯代物，再與羧酸或氨基酸反應合成β-欖香烯醇酯類化合物，可以提高體外抗癌活性。通過親核取代反應合成β-欖香烯單取代胺類衍生物，其抗腫瘤活性較β-欖香烯明顯提高。β-欖香烯的水溶性衍生物β-欖香烯嗎素（PIC-BE） 對多藥耐藥K/ADM 細胞不僅具有明顯的生長抑制作用，而且顯著地誘導細胞凋亡，說明β-欖香烯嗎素是一種有效的抗腫瘤化合物，且已產生MDR的K/ADM 細胞對它不具耐藥性。

    β-欖香烯嗎素能明顯阻滯細胞周期（G期細胞升高，S期細胞下降），它不僅能誘導細胞凋亡的發生，貫穿全程且呈逐漸增強趨勢。
4 欖香烯的由來及現狀
    β-欖香烯系揮發油類，可從多種香精或揮發油中提取。研究初期筆者使用溫莪術（Curcuma.Wenyujin Chen）揮發油，通過多次精密分餾，再經過多次柱層析得到“β-欖香烯”，經氣相色譜測定（填充柱，柱效按β-欖香烯計算不低于1000），結果為單峰。

    1981年，課題組時繼慧等研究發現了筆者分離的“β-欖香烯”具抗癌作用，并在《中藥通報》上發表了題為：溫莪術揮發油實驗藥理研究β-欖香烯的抗癌作用。此后我們請中國醫學科學院對我們分離的“β-欖香烯”的抗癌活性進行了復核，實驗結果與我們報導的結果基本吻合，于1984年在《中藥通報》上發表了β-欖香烯的抗腫瘤作用和藥理學研究。

    此后，1986年，“重大疾病防治藥物β-欖香烯” 專題正式納入國家“七五”科技攻關計劃（專題合同編號：號75-63-01-11）。 隨著科技的發展，色譜技術也不斷提高。毛細管氣相色譜和氣-質聯用儀的使用，我們發現以前我們研究報道的“β-欖香烯”不是單體。其中含β-欖香烯65%以上，還有γ-欖香烯、δ-欖香烯、欖香醇和異呋咭嗎烯等雜質。

    因當時我國《藥品管理法》和《新藥審批辦法》剛頒布，新藥研發處于起始階段，針對我們研制的具體情況向國家醫藥局進行了請示，醫藥局指示：不管是不是β-欖香烯單體，只要是從中藥中提取的抗癌有效成分，能開發成新藥就行。

    1992年該研究由“七五”轉入“八五”國家科技攻關計劃（專題合同編號：85-922-02-14），由于課題的延續性， “八五”攻關的專題名稱仍然是“β-欖香烯抗癌臨床應用及開發研究”，課題的內容是按《新藥審批辦法》從中藥溫莪術中提取含β-欖香烯的有效部位，并開發西藥二類新藥。

    我們按規定完成了研究任務，并經與新藥審評辦公室化學組研究協商，將含β-欖香烯65%以上、β-欖香烯與δ-欖香烯和γ-欖香烯三者總和在含量85%以上的原料藥定名為“欖香烯”。 欖香烯乳注射液及其制備方法獲國家發明專利（專利號ZL93 1 10091.7國際專利主分類號A61K 31/12）。欖香烯及其制劑作為國家二類新藥已由大連金港制藥有限公司獨家生產。
5 β-欖香烯與欖香烯的關系
　　從欖香烯的由來可知，欖香烯不是以前文獻中的已知化合物，而是新命名的藥品名稱。β-欖香烯與欖香烯的混淆是歷史原因造成的。1996年以前國內的研究及論文中出現的“β-欖香烯”，不是真正的單體β-欖香烯，而應是欖香烯。

    1996年，我們繼“八五”國家科技攻關之后，繼續進行了“九五”國家科技攻關計劃（專題合同編號：K95-12-21）研究，專題名稱為“β-欖香烯（單體）抗癌的研究”，是以（單體）來與“七五”和“八五”中的“β-欖香烯”相區別的。應該說此后我們的研究是以β-欖香烯為主，我們提供的β-欖香烯（單體）進行的許多研究及發表的論文應是β-欖香烯。

    但由于欖香烯（過去稱β-欖香烯）從90年代就已進入臨床應用，近20年中很多人用欖香烯進行了大量的臨床及基礎研究并發表了許多研究論文，故1996年以前發表的論文中出現的“β-欖香烯”應是欖香烯，1996年后實驗用β-欖香烯還是欖香烯，則應根據取材而定。
6 β-欖香烯現狀及展望
　　 以β-欖香烯為有效成分的抗癌藥物的制備方法及其組成獲國家專利（專利號：ZL 98 1 06848.0 國際專利主分類號A61K 31/015）和美國專利（Patent No:US 6,464,839 BI）。β-欖香烯作為國家一類西藥已由大連遠大制藥有限公司進行開發研究，目前已進入二期臨床試驗，有望短期內推向醫藥市場。

    然而，目前的研究還不夠系統和深入，尤其是對于β-欖香烯的作用部位、作用通路，以及β-欖香烯抑癌基因的影響還不十分清楚。另外多數研究僅限于國內，國外的論文極少。當然，β-欖香烯還沒走向市場，市面買不到β-欖香烯，這在某種程度上影響它的廣泛研究。故希望有關單位，特別是國家科技部應重點組織聯合科技攻關。使具有特色、為數不多的我國獨立開發的β-欖香烯抗癌新藥走出國門，為人類戰勝癌癥作貢獻。

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