鹽酸多奈哌齊片對擬血管性癡呆大鼠海馬神經元保護機制的研究

    血管性癡呆（VD）是由各種原因引起的慢性腦灌注不足所致的認知功能障礙, 海馬CA1區是缺血缺氧最敏感的部位，N�布谆��睤�蔡�(門)冬氨酸受體（NMDAR）��1（NR1）是NMDAR的功能亞基，代表NMDA分布。鹽酸多奈哌齊片是近年來用于治療VD的膽堿酯酶抑制劑。本研究通過建立擬VD模型，采用對照研究的方法觀察實驗動物海馬CA1區神經細胞形態學變化、NR1表達和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH�睵X）、過氧化氫酶（CAT）的活力，探討鹽酸多奈哌齊片神經保護機制。

    1 材料與方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 動物及分組 雄性SD大鼠48只（購自鄭州大學實驗動物中心），質量（400±50）g,隨機分為假手術組、VD對照組和多奈哌齊組，每組16只。
　　1.1.2 主要儀器及試劑 MG��2 Y�残兔詫m（張家港市生物醫學儀器廠）；NR1免疫組化試劑盒（博士德生物工程有限公司）；GSH�睵X、CAT試劑盒（南京建成生物工程研究所）；鹽酸多奈哌齊片（法國PFIZER PGM公司制造，衛材中國藥業有限公司分裝）。
　　1.2 方法
　　1.2.1 模型制備及藥物干預 將大鼠用10%的水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰臥固定在手術臺上,常規消毒,頸正中切口,分離雙側頸總動脈（CCA）。VD對照組和多奈哌齊組腹腔注射硝普鈉(2.5 mg/kg,用無菌蒸餾水溶解)，隨即將CCA夾閉、再通、再夾閉各10 min后再通，縫合傷口，放回籠中保溫飼養。假手術組不阻斷CCA，不注射硝普鈉，余操作過程相同。造模過程中保持動物肛溫在37℃左右，以防止低溫對腦缺血損傷的保護作用。多奈哌齊組于大鼠完全清醒4 h后，給予多奈哌齊1 mg/kg（溶解于生理鹽水中）灌胃，每日1次共30 d；假手術組和VD對照組給予生理鹽水1 ml共30 d。
　　1.2.2 Y�残兔詫m試驗 術后第25 d行迷宮測試，先將大鼠放入迷宮中適應3～5 min，然后以無規則次序變換安全區，以訓練大鼠辨別燈光刺激及安全方位的能力。大鼠受電擊逃到安全區后以大鼠所在支臂作為下一次測試的起始位置，每個實驗日在固定時間（下午5～8點）對每只大鼠進行20次訓練,連續5 d。以大鼠在足底通電后10 s內一次性跑向安全區為正確反應，否則為錯誤反應；全天完成所有反應所需時間稱為全天總反應時間 (TRT)。每日出現錯誤反應次數(EN)≤2次、TRT≤120 s作為判定大鼠學習記憶的標準。
　　1.2.3 NR1表達水平檢測 術后第30 d行為學測試完畢后每組隨機選取8只大鼠麻醉后經心臟灌注內固定取腦，在鼠腦最寬部位（海馬冠狀位）取厚度為3 mm的腦片，置4%多聚甲醛溶液中固定24 h，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，連續冠狀切片，片厚約5 μm，每只大鼠取5張切片，分別進行HE染色及SP免疫組化染色檢測NR1表達水平，實驗步驟嚴格按說明書進行。采用Qwin 550 CW圖像處理與分析系統，每張切片同一區域中，隨機選取8個視野，檢測面積大致相同，采集8組數據，取均值作為該切片NR1的平均灰度值。
　　1.2.4 GSH�睵X、CAT活力測定 各組另外8只大鼠麻醉后斷頭，冰盤上取腦，小心剝離海馬，按標本質量用生理鹽水配成10%的腦勻漿，低溫、3500 r/min、離心10 min，取上清液，按GSH�睵X、CAT試劑盒說明操作測出光密度（OD）值，用考馬斯亮藍檢測標本蛋白質含量，并計算出酶活力。OD值越高，酶的活力越低。
　　1.2.5 統計學方法 數據以均值±標準差(±s)表示，使用SPSS10.0統計軟件，兩樣本均數間采用t檢驗，組間均數的顯著性檢驗用單因素方差分析，滿足正態分布及方差齊性要求時采用LSD法，不滿足方差齊性要求時, 則采用Dunnett�餋法。

    2 結果
　　2.1 各組大鼠學習記憶成績的比較 見表1。與對照組相比，假手術組和多奈哌齊組，EN明顯減少，TRT明顯縮短(均P<0.01），假手術組和多奈哌齊組間差異無統計學意義。
　　2.2 各組腦組織形態學改變的比較 見圖1～3。HE染色可見假手術組大鼠海馬CA1區神經細胞數目多，排列緊密、均勻而整齊，胞核呈圓形或橢圓形，核仁明顯，染色質均勻；對照組神經細胞結構松散、數目減少、排列紊亂，胞核深染、固縮，核仁消失，胞漿周圍發現空暈，胞間距較大，并可見大量不規則形膠質細胞及散在膠質細胞增生小結，僅見少量正常神經細胞；多奈哌齊組正常神經細胞數目較多，排列較密，胞核圓或橢圓形，核仁清晰，染色質豐富，少見固縮變性的神經元。
　　2.3 各組NR1分布及免疫灰度值的比較 見圖4～6及表2。假手術組海馬CA1區層次清、排列緊密，可見NR1陽性神經元胞膜呈黃色，胞漿較淡，胞體大圓或橢圓形；對照組層次減少，排列稀疏，殘余的NR1陽性神經元胞膜呈深棕黃色，并可見胞核著色；多奈哌齊組神經元數目明顯增多，層次清，排列較密，NR1陽性神經元明顯減少且染色淡黃。NR1陽性神經元免疫反應灰度值假手術組與多奈哌齊組間差異無統計學意義，且顯著低于對照組（均P<0.01）。
　　2.4 各組GSH�睵X、CAT活力的比較 見表2。對照組GSH�睵X、CAT的活力低于多奈哌齊組及假手術組（P<0.0５～0.01）；多奈哌齊與假手術組間差異無統計學意義。
　
    3 討論
　　VD的確切發病機制目前尚不清楚。以谷氨酸受體為代表的興奮性氨基酸受體,特別是NMDAR在中樞神經系統與短時學習記憶的形成密切相關,并可以產生興奮毒性作用導致神經元丟失。腦缺血后NMDAR活化是導致腦缺血后學習和記憶障礙的一種重要因素。有研究表明，缺血后NMDAR表達增加，并導致胞內鈣超載觸發系列生化改變，誘導相關基因的表達可能是導致海馬細胞死亡的重要原因。
　　本實驗結果發現，對照組神經細胞結構松散、數目及層次減少、排列稀疏，殘余的NR1陽性神經元表達顯著增高，表現為胞膜著色明顯加重，呈深棕黃色，并可見胞核著色，GSH�睵X、CAT的活力卻低于假手術組和多奈哌齊組；多奈哌齊組的神經元數目明顯增多，層次清、排列較密，NR1陽性神經元明顯減少且染色淡黃，只見到部分神經元著色， CAT、GSH�睵X活力較對照組有較明顯地提高。表明鹽酸多奈哌齊片對缺血缺氧的神經元有較顯著的保護作用，其機制可能為：（1）拮抗NMDAR，主要是下調NR1的表達，來阻斷由其引發的鈣超載，進而阻斷一系列導致的神經元損傷的級聯反應；（2）提高抗氧化酶�睪SH�睵X和CAT的活性，對抗過氧化氫導致的神經元損傷。
　　Akasofu 等的研究發現，鹽酸多奈哌齊片對處于缺血缺氧環境下的原代培養神經元預處理12 h后，可減少乳酸脫氫酶（LDH）引發的NMDA釋放和海人酸的釋放，進而降低鈣的濃度，減少細胞內鈣超載,從而減輕了由NMDA誘發的神經元損傷。有研究發現鹽酸多奈哌齊片可改善缺血腦組織的代謝、對抗細胞凋亡而起到保護神經元的作用。
總之，NR1的表達增高和GSH�睵X、CAT活力的降低與VD發病有關，鹽酸多奈哌齊片不僅可以通過促進腦部乙酰膽堿的功能來改善認知障礙，而且也可能通過降低NR1的表達，提高GSH�睵X、CAT的活性等多途徑的分子生物學機制來減輕神經元損傷。

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