復方紅豆杉膠囊對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響

    復方紅豆杉膠囊是中藥復方制劑，由紅豆杉、紅參、甘草3味中藥組成，適用于肺癌、胃癌、大腸癌、肝癌、口腔癌等中晚期癌癥的治療［1～3］，對放化療有增效作用。復方紅豆杉膠囊臨床上抗腫瘤作用療效確切，但是否具有抑制腫瘤血管生成的作用，目前尚未見報道。本研究利用雞胚絨毛尿囊膜法觀察復方紅豆杉膠囊對血管生成的影響。

    材料與儀器

    1.1 藥品與試劑復方紅豆杉膠囊（重慶賽諾生物藥業股份有限公司，批號：090301）；硫酸魚精蛋白注射液（上海第一生化藥業有限公司，批號：080102）；新潔爾滅（南昌白云藥業有限公司，批號：080501）；水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司，批號041210）；丙酮（南京化學試劑廠，批號：990407）；甲醇（江蘇漢邦科技有限公司）。

    1.2 動物清潔級雄性SD大鼠，體質量（200±20）g，由浙江省實驗動物中心提供（許可證號：20080033）。新鮮種蛋，產出兩天內用于實驗，蛋重50～60 g，由南京市六合區黃木橋孵化場提供。

    1.3 儀器AIR TECH超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司）；Forma series ⅡCO2培養箱（美國Thermo公司）；光學顯微鏡（重慶光學儀器廠）。

    方法

    2.1 含藥血清的制備清潔級雄性SD大鼠，常規飼養。復方紅豆杉膠囊低劑量和高劑量分別按成人（60 kg）體重的6倍（180 mg/kg）和12倍（320 mg/kg）灌胃給藥,空白血清組大鼠每天灌胃相同體積的蒸餾水。以上各組灌胃1次/d，連續灌胃7 d。于末次灌胃2h后，水合氯醛麻醉（35 mg/kg），腹主動脈取血，3 000 r/min，10 min離心，取上層血清。無菌濾器（直徑0.2 μm）過濾除菌，密封，-20℃保存。

    2.2 CAM模型的制備

    2.2.1 種蛋的孵育選擇產出2d內的新鮮種蛋，先用溫水清洗2次，再用1∶1000的新潔爾滅清洗表面，最后在超凈臺內用75%酒精擦拭表面，放入無菌培養箱孵育，設定溫度在37℃，濕度在40%～60%。種蛋大頭朝上，45°傾斜。為促進羊膜運動，防止胚胎發生粘連，每天翻蛋4次。

    2.2.2 雞胚的檢查使用聚光燈源，自制照蛋燈。每天觀察胚胎發育情況，隨時淘汰未受精、死胎及胚胎發育不良的種蛋。

    2.2.3 假氣室的制備種蛋孵育至第7天，無菌條件下，在種蛋氣室端打一個1～2 mm的小孔，滴加50 μl生理鹽水使雞胚絨毛尿囊膜下陷，洗耳球從小孔處吸氣，使雞胚絨毛尿囊膜與殼膜分離，用彎頭鑷剝去蛋殼開窗（約1.0 cm×1.0 cm），去除殼膜，制成假氣室。用滅菌透明膠密封開窗處，繼續孵育24 h。

    2.3 藥物對CAM的作用隨機分為生理鹽水組，硫酸魚精蛋白組，空白血清組，復方紅豆杉膠囊低高劑量組5組。開窗24 h后，超凈臺內揭去透明膠，將滅菌好的擦鏡紙片作為載體放在CAM的血管最少處，每枚種蛋加藥量為10 μl，將其輕輕加到載體上。加藥后，用透明膠封閉窗口，標記后繼續孵育。48 h后，記錄雞胚存活率，揭去透明膠，固定液（乙醇∶丙酮1∶1）固定15 min，以載體為中心，剪下CAM，水中展開后，鋪于濾紙上，拍照，顯微鏡下觀察血管數。以載體為中心，1 mm以內為一級血管，5 mm內為二級血管，一、二級血管分別觀察分析。

    2.4 統計學方法 數據以±s表示，進行組間t檢驗。

    結果

    3.1 復方紅豆杉膠囊對雞胚存活率的影響

    復方紅豆杉低、高劑量組血清作用于CAM后，對雞胚的存活率未見明顯影響。

    3.2 復方紅豆杉膠囊對CAM血管形態的影響 

    生理鹽水組和空白血清組血管生長正常，硫酸魚精蛋白組、復方紅豆杉膠囊低、高劑量組血管計數明顯減少，血管顏色蒼白、變淺，載體放置部位無血管生成。

    3.3 復方紅豆杉膠囊對CAM血管生成的影響

    硫酸魚精蛋白組、復方紅豆杉膠囊低、高劑量組明顯抑制血管的生成，與生理鹽水組、空白血清組相比，有顯著性差異（P<0.01）。

    討論

    血管生成是指從已存在的血管中長出新的毛細血管的過程。腫瘤的生長和轉移都依賴于新生血管的形成。新生血管為腫瘤的生長提供營養和排出廢物，刺激腫瘤生長，促使腫瘤向其他組織器官轉移。原發灶血管數量的增多，增加了腫瘤轉移的可能性，即新生血管形成與腫瘤的轉移傾向呈正相關。因此，抑制腫瘤血管生成已成為近年來控制腫瘤生長和抗腫瘤轉移研究中的熱點之一。

    復方紅豆杉膠囊由紅豆杉、紅參、甘草三味中藥組成。紅豆杉的提取物紫杉醇是治療轉移性卵巢癌和乳腺癌的有效藥物之一。研究表明紫杉醇對血管生成有很強的抑制效應，證實紫杉醇是一種血管生成抑制因子。紫杉醇能夠明顯抑制裸鼠肝癌的血管生成，是一種極其有效的化療藥物。其作用機理可能是通過與微量蛋白結合，促進其聚合，抑制細胞的有絲分裂，有效地阻止腫瘤細胞的增殖。

TAG：復方紅豆杉膠囊｜雞胚絨毛尿囊膜｜血管生成