高效液相色譜法同時測定抗栓膠囊中5種大黃成分的含量

抗栓膠囊是安徽中醫學院第一附屬醫院院內制劑,曾用名為通腦精膠囊,該方由大黃、川芎等4味中藥組成,功能行氣化痰、活血解毒,主要用于治療老年性中風[1]等疾病。前期研究過程中曾對其中大黃素的含量進行了薄層色譜法的含量測定[2]。為了建立該制劑的規范化定量分析方法,更好地控制本品質量,本課題組對該制劑進行了含量測定方面的提高研究。本試驗采用高效液相色譜(HPLC)法對其君藥大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚5種成分的含量同時進行測定。現報道如下。

　　1 儀器與試藥

　　WATERS高效液相色譜儀(600泵,2487檢測器,Millennium32工作站),BP211D電子天平(德國塞多利斯公司),HH-S型水浴鍋(鞏義市英峪予華儀器廠),500 mL調溫電熱套(上海浦東新區電理儀器廠),SK3200H超聲清洗器(上海科導儀器有限公司)。

　　抗栓膠囊含量測定用對照品均購自中國藥品生物制品檢定所,批號分別為：蘆薈大黃素0795-200605,大黃酸0757-200005,大黃酚0796-2002081,大黃素0756-200110,大黃素甲醚0758-200610。甲醇為色譜純;水為二次重蒸水;其他試劑均為分析純。

　　2 方法與結果

　　2.1 色譜條件及系統適用性試驗

　　色譜柱：Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 ?m);柱溫：25 ℃;檢測波長：254 nm;流動相：甲醇-0.1%磷酸(85∶15);流速：1.0 mL/min;進樣量20 /L。理論板數以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚計算均不低于10 000,5個成分與相鄰峰之間分離度均大于1.5,對稱因子在0.95～1.05之間。

　　2.2 對照品溶液的制備

　　精密稱取五氧化二磷減壓干燥的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量,加甲醇分別制成1 mL含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚各約0.2 mg的溶液;分別精密量取上述對照品溶液2 mL置10 mL量瓶中,混勻,即得。

　　2.3 供試品溶液的制備

　　參照文獻[3-4]隨機取黃芎抗栓膠囊5粒,除去膠囊殼,內容物混勻,精密稱取內容物約0.5 g,置具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱定重量,超聲(功率300 W,頻率50 kHz),放冷,再稱定重量,用甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過。精密量取續濾液5 mL,置燒瓶中,揮去溶劑,加8%鹽酸溶液10 mL,超聲處理2 min,再加三氯甲烷10 mL,加熱回流1 h,放冷,置分液漏斗中,用少量三氯甲烷洗滌容器,并入分液漏斗中,分取三氯甲烷層,酸液用三氯甲烷提取3次,每次10 mL,合并三氯甲烷液,減壓回收溶劑至干,殘渣加甲醇使溶解,轉移至10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續濾液,即得。

　　2.4 專屬性試驗

　　按處方比例制成缺大黃陰性對照品,按“2.3”項下方法制備缺大黃陰性樣品溶液。精密吸取上述對照品、供試品、陰性樣品溶液各20/L,照“2.1”項下色譜條件測定。結果陰性樣品溶液在各對照品保留時間位置上均未見干擾。

    2.5 線性關系考察

　　精密量取含蘆薈大黃素(0.230 mg/mL)、大黃酸(0.224 mg/mL)、大黃素(0.223mg/mL)、大黃酚(0.257 mg/mL)、大黃素甲醚(0.287 mg/mL)的混合對照品溶液0.5、1、2、4、8 mL,分別置10 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勺,0.45 ?m微孔濾膜濾過,按“2.1”項下的色譜條件測定,每次進樣20 ?L。以進樣濃度(?g/mL)為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸,計算其回歸方程及線性范圍。蘆薈大黃素：Y=161 803X-131 692,r=0.999 8,線性范圍0.230～3.68 ?g;大黃酸：Y=154 631X+52 006,r=0.999 9,線性范圍0.224～3.584 ?g,大黃素：Y=152 878X-791 770,r=0.999 8,線性范圍0.223～3.568 ?g;大黃酚：Y=163 597X-129 101,r=0.999 9,線性范圍0.257～4.112 ?g;大黃素甲醚：Y=158 720X-132 792,r=0.999 8,線性范圍0.287～4.592 ?g。

　　2.6 精密度試驗

　　精密量取供試品溶液20 ?L,連續進樣5次,測得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.78%、0.91%、0.37%、0.46%、0.24%,表明精密度較好。

　　2.7 穩定性試驗

　　取供試品溶液,分別在0、2、4、8、12、24 h按“2.1”項下色譜條件測定,測得樣品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.78%、1.06%、1.86%、2.19%、2.37%,表明供試品溶液在24 h內穩定。

　　2.8 重復性試驗

　　取同一批樣品,平行制備 6 份供試品溶液,按上述色譜條件測定峰面積并計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚的含量,其RSD分別為2.11%、1.93%、1.58%、1.94%、2.41%。

　　2.9 加樣回收率試驗

　　精密稱取已知含量的樣品(含蘆薈大黃素2.359 mg/g、大黃酸3.695 mg/g、大黃素3.137 mg/g、大黃酚4.257 mg/g和大黃素甲醚1.996 mg/g)6份,每份適量,分別精密加入一定量的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品,按“2.3”項下方法制成溶液,按上述色譜條件測定,計算回收率。結果見表1。表1 加樣回收率試驗結果(n=6)

　　2.10 樣品的測定

　　取3批抗栓膠囊,按“2.3”項下方法制備供試品,每批樣品3份。精密吸取供試品溶液20 /L,按照上述色譜條件測定并計算含量,結果見表2。表2 黃芎抗栓膠囊中5種大黃成分含量測定結果(mg/g,n=3)

　　3 討論

　　抗栓膠囊由大黃、川芎等4味中藥組成,大黃為方中君藥,通過控制大黃中有效成分的含量可以很好地控制該制劑的質量。大黃中蒽醌類成分含量測定方法文獻報道較多,色譜條件及制備方法也多種多樣,但多采用單一成分含量的測定,不能全面控制制劑的質量。本課題組在以往的研究中曾用薄層色譜法測定了3批樣品中大黃素的含量,本試驗的目的旨在更進一步提高該制劑的質量控制水平。由于大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚5種蒽醌類成分的含量均較高,故選擇以上5種蒽醌類成分作為含量測定的指標成分。筆者在本項目的研究工作中,參照2005年版《中華人民共和國藥典》(一部)“大黃”項下制備方法[5],并采用其測定波長254 nm同時對5種蒽醌類成分進行定量測定,試驗結果表明該方法可行,分離度較高,可作為抗栓膠囊的質量控制方法。

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