金路捷注射用鼠神經生長因子受體TrkA在中樞神經系統的表達、分布和作用

    神經生長因子（nerve growth factor,NGF）是一種經典的神經營養因子。NGF在周圍神經系統（peripheral nervous system,PNS）參與交感神經元、神經嵴起源的感覺神經元的發育、存活，維持及損傷修復等作用已逐漸為人們所認識。八十年以后，人們發現NGF對中樞神經系統（certral nervous system,CNS）中基底前腦（basal forebrain）膽堿能神經元有作用。而作用于該部膽堿能神經元的NGF主要由靶區（海馬及新皮質）產生，經逆行運輸到膽堿能神經元胞體，發揮其靶源性營養作用。大量的研究表明這類神經元亞群在學習和記憶中具有特殊功能。
　　
    在培養PC12細胞的培養基中加入NGF時，能誘導PC12突起的生長并使酶的活性提高，但當注射NGF到PC12細胞體或胞核時，并不發生以上變化，從而說明NGF生理功能的啟動是由膜受體介導的。進一步研究發現，NGF效應細胞膜上有兩種受體類型，根據其對NGF的親和性分為高親和力受體（high affinity receptor,HNGFR）和低親和力受體（low affinity receptor,LNGFR）。LNGFR是一種富含半胱氨酸的糖蛋白，其分子量為75kD,所以又稱p75。LNGFR胞質部分沒有ATP結合位點，致使NGF與p75結合后不能活化內源性激酶，故NGF與p75的結合不能直接發揮生物學效應，但能通過增加HNGFR與NGF的結合率，影響通過HNGFR進行的信號傳遞。1991年Klein[1]等研究發現HNGFR是由酪氨酸激酶原癌基因（tyrosine kinase proto-oncogene,TrK）表達的一種跨膜糖蛋白，分子量為140kD。現已知HNGFR至少有一個亞基由TrkA原癌基因編碼。TrkA由三部分組成：即辨別并結合NGF的細胞外部、跨膜部及含酪氨酸激酶的胞質部。TrkA是NGF的功能性受體，當其與NGF結合后，可激活酪氨酸激酶信號傳遞系統，從而啟動細胞活性，產生生物效應。Boissiere[2]等用免疫組化方法檢測人基底前腦，發現99%膽堿能神經元有TrkA表達；有人用原位雜交和免疫組化方法發現TrkA mRNA和蛋白質廣泛地分布于大鼠中樞神經系統[3]。在基底前腦表達TrkA mRNA的膽堿能纖維廣泛地投射到海馬和新皮質。

　　1 發育過程中基底前腦TrkA表達的變化

　　利用免疫組化方法證實在成年大鼠基底前腦的膽堿能神經元有p75和TrkA的表達[4]，有人用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）探及到胚胎17天大鼠基底前腦膽堿能神經元無TrkA mRNA表達[5]，生后3天到2周才發現有TrkA mRNA的表達；Li[6]等用原位雜交和Northern印跡等方法定量分析TrkA mRNA、ChAT mRNA在大白鼠胚胎、生后、成年基底前腦內側隔核（MS）的變化。發現胚胎17天時均無表達，生后0天少數幾個細胞表達TrkA mRNA、ChAT mRNA；生后4天至11天，兩者表達明顯增加，生后21天表達最強，高于成年鼠的水平。生后30天呈下降趨勢，在成年鼠維持在一個相對穩定比較高的水平。TrkA mRNA和ChAT mRNA的表達有相似的時空模式。最近有人用免疫組織化學方法觀察TrkA表達，無ChAT表達，生后5天可見ChAT表達，生后20天TrkA mRNA表達達高峰；生后30天下調，成年時維持相對較高水平，老年時TrkA mRNA表達明顯下調。大鼠基底前腦Meynert基底核TrkA表達早于ChAT表達。從生后5天起，TrkA、ChAT表達有相似的時間模式。TrkA可能參與Meynert基底核膽堿能神經元的發育、分化、成熟。NGF mRNA、TrkA mRNA在發育過程中的變化對于基底前腦膽堿能神經元的存活及突起形成可能起一定的調節作用。在腦發育不同階段基底前腦膽堿能神經元TrkA基因表達具有階段性差異，Hsiang[7]等用原位雜交方法發現，在出生后1天大鼠基底前腦膽堿能神經元沒有測到TrkA基因，以后逐漸增加，4周時達最高水平，這種發育階段的變化與海馬及皮質中NGF mRNA基因表達的變化有平行關系[8]，提示NGF對膽堿能神經元發育的調控作用，也反應了這個過程中NGF受體對這種調控的參與。

　　2 老齡鼠和阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）病人基底前腦膽堿能神經元TrkA、ChAT表達的變化

　　Cooper[9]等將125I-NGF注射入成年大鼠和老齡大鼠（26～30個月）海馬內，發現老齡鼠內側隔核能攝取和逆行轉動125I-NGF的ChAT免疫反應神經元數目減少31%，不能攝取和逆行轉運125I-NGF的膽堿能神經元嚴重萎縮、胞體的平均面積減少60%，同時，TrkA mRNA表達下調43%，而p75沒有差異。表明老齡鼠基底前腦膽堿能神經元維持受體介導靶源性神經營養因子的攝取和逆行轉運能力下降，導致NGF信號傳遞功能削弱。增加了老年動物膽堿能神經元變性的易感性。最近我們用免疫組織化學方法發現老齡鼠（Meynert）基底核（basal nucleus of Meynert,nBM）TrkA、ChAT-IR神經元萎縮、數量分別減少31.9%、37.5%；胞體平均截面積分別減少39.4%、30.4%；平均灰度分別減少11.8%、9.9%。早老性癡呆是由于基底前腦膽堿能神經元的變性死亡及相應皮質、海馬神經元退化所引起的老年神經元退行性疾病，其主要臨床表現為學習及記憶功能障礙，導致嚴重的智力低下。多數學者認為AD病因主要與乙酰膽堿能系統改變有關。Boissiere[10，11]等用原位雜交方法發現AD病人與老年人對照組比較，nBM膽堿能神經元TrkA mRNA表達減少75%，差異有顯著性（P＜0.001）；腹側紋狀體（ventral atriatum）TrkA mRNA表達減少41%（P＜0.01）。豆狀核殼（putamen）TrkA mRNA表達減少43%～53%（P＜0.01）。Mufson[12]等用原位雜交方法發現AD病人與老年人對照組比較，nBM膽堿能神經元TrkA mRNA表達減少66%，用逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）方法也得出同樣的結論。進一步用免疫組化方法研究發現：AD病人nBM內膽堿能神經元TrkA蛋白質表達與老年人對照組比較，AD病人nBM內幸存的TrkA iR陽性神經元數量減少60%，染色密度減少35%，細胞外形皺縮，樹突截斷變形，整個細胞呈腫脹的球形外觀（swollen globose appearance）[13]。

　　3 TrkA對于基底前腦膽堿能神經元的作用

　　Fagan[14]等將小鼠基底前腦、紋狀體膽堿能神經元編碼TrkA受體的基因失活（TrkA-/-）發現生后7天小鼠基底前腦、紋狀體膽堿能神經元ChAT-IR陽性產物胞體的平均截面積減少10%～20%；生后20～25天小鼠ChAT-IR陽性神經元數目20%～36%，胞體萎縮變小，ChAT免疫反應性降低，胞體和膽堿能神經纖維氈標記密度減少，表明正在發育的（TrkA-/-）小鼠膽堿能神經元ChAT表達減少，阻礙發育成熟。結果表明正在發育（TrkA-/-）小鼠膽堿能神經元ChAT的表達減少，細胞死亡增加。（TrkA-/-）小鼠基底前腦膽堿能神經元丟失與生后1～4周時，靶源性神經營養因子缺失導致細胞死亡是一致的[15]。缺乏TrkA受體，NGF不能與特異性的受體結合，不能進行細胞內信號傳遞，正在發育的基底前腦膽堿能神經元不能充分地發育成熟。

　　4 TrkA與ChAT、雌激素受體（estrogen receptor,ER）共存

　　Sobreviela[16]等用免疫組化方法發現：內側隔核和斜角帶核內95%以上TrkA免疫反應陽性神經元內既含有ChAT也含有p75 nGFR；Meynert基底核內80%以上TrkA免疫反應陽性神經元內含有ChAT，95%以上的TrkA免疫反應陽性神經元內含有p75。Gibbs[17]等用免疫組化方法證明50%～80%的膽堿能ChAT免疫反應神經元內含有ER，雌性大鼠較雄性大鼠多10.5%。紋狀體內雙標細胞占74.2%，斜角帶核水平支內為63.4%。Toran[18，19]等用放射自顯影和原位雜交、免疫組化方法發現基底前腦膽堿能神經元含有雌性激素的高親和性連接位點，即雌激素受體，屬核受體，為一核轉錄因子。結果提示它們的配體（神經營養因子、雌性激素）可能作用于同一神經元，協同調節細胞內特異的基因或者基因網絡的表達。從而調控mRNA的細胞內組成，影響蛋白質生成的量及其性質，最終影響神經元的存活、分化、再生和可塑性。

　　5 雌性激素對于基底前腦膽堿能神經元TrkA mRNA和ChAT mRNA表達的調節

　　Pamela[20]等人將成年大白鼠卵巢切除后10天，HDB和nBM內TrkA mRNA表達水平分別下調56%和34%，而ChAT mRNA分別下調38%～65%，與Gibbs[21]等人研究結果相似。雌性激素替代治療3天后，TrkA mRNA、ChAT mRNA表達恢復到未切卵巢的動物的水平，而VDB中的TrkA mRNA、ChAT mRNA表達沒有明顯的差異。Gibbs[22]等觀察鼠齡分別為13個月、19個月和25個月的雄性、雌性大鼠，發現年齡對于MS、nBM內ChAT、p75免疫反應陽性神經元的細胞大小、纖維染色密度的影響沒有顯著性差異，13～25個月齡鼠中，25個月齡鼠TrkA mRNA明顯地減少。將13個月齡鼠卵巢切除6個月后，MS、nBM內TrkA mRNA、ChAT mRNA明顯地減少，短期內雌性激素替代治療后，MS、nBM內TrkA mRNA、ChAT mRNA明顯地減少，短期內雌性激素替代治療后，MS、nBM內TrkA mRNA、ChAT mRNA部分恢復。結果提示卵巢分泌的雌激素對于大白鼠基底前腦MS、nBM內TrkA mRNA、ChAT mRNA維持正常水平發揮重要作用。卵巢切除后，MS和nBM內TrkA mRNA表達減少，對于內源性的神經生長因子效應降低，基底前腦對于衰老和疾病的易感性增加，膽堿能神經元的功能下降。因此，長期的卵巢功能喪失，對基底前腦膽堿能神經元將產生不利影響。雌性激素替代治療絕經后的婦女有助于減少其患AD病的可能。

　　6 雌性激素和NGF協同作用，可望應用于臨床

　　雌性激素能夠上調神經營養因子和它們的受體的表達，而NGF能夠增加ChAT mRNA的數量，增強ChAT的活性，從而增加Ach的釋放。雌性激素對于膽堿能系統神經元的營養作用可能部分地經過神經營養因子與其受體結合后傳遞信息而被介導。Gibbs等研究發現雌性激素的劑量和給藥治療的周期不同，它對神經營養因子基因以及受體的表達有不同的效果。臨床應用中絕經后的婦女用雌性激素替代治療可以預防AD病的發生[21]，但是乳腺癌發病率明顯增高這一副作用也不容忽視。雌性激素和NGF協同應用于臨床還有待于進一步的探索。

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