泰特抗白血病免疫佐劑作用實驗研究

    人們很早就發現，腫瘤組織內及其周圍存在著大量T/NK細胞。與機體其他部位相比，腫瘤及其周圍組織中的T/NK細胞功能顯著降低［1］。當今，常以T/NK細胞為效應細胞，以IL-2為刺激劑作為腫瘤的過繼性免疫治療的手段，但對大部分病人療效不佳，其原因是腫瘤及其周圍組織內也存在大量富含單核/巨噬細胞的單個核細胞 (Mo)。 Mo 對荷瘤動物淋巴細胞抗腫瘤作用有抑制效應，這種抑制作用與Mo分泌反應性氧代謝物（reactive oxygen metabolites，ROM）密切相關［2］。二氫氯化物組胺（簡稱組胺）可以逆轉ROM對T/NK抗腫瘤活性抑制作用，并且已做II期臨床試驗，效果明顯［1］，但其毒副作用大，臨床難于應用。為了尋求高效低毒、便于臨床應用的ROM逆轉劑，我們進行了還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）在體外白血病細胞株培養體系中逆轉ROM、增強NK細胞殺傷K562細胞的實驗研究，現將結果報道如下。

　　材料和方法

　　材料

　　K562細胞株由福建醫科大學附屬協和醫院老年病研究所朱元貴博士惠贈，新鮮健康人單的采白細胞由泉州市中心血站提供，IL-2為北京雙鷺藥業公司產品，二氫氯化物組胺、GSH和MTT均為Sigma公司產品，CD3、CD56免疫組織化學試劑盒為北京中山公司產品，活性氧測試劑盒為南京建成公司產品。

　　方法

　　富含NK細胞的單個核細胞（E）的分離 采用Percoll不連續密度梯度分離法［2］分離，采用免疫組織化學法進行鑒定［3］，其純度達30%，活存率≥95%。

　　富含單核細胞的單個核細胞（Mo)的分離 采用Colotta方法［2］分離并作非特異性酯酶染色鑒定純度，4℃冷藏備用，其純度為70%，活存率≥95%。

　　細胞培養及檢測

　　將富含NK細胞的單個核細胞(E)、K562細胞(T)按E/T比10∶1、10∶5、10∶10 3個比例加入相應的96孔培養板中（NK細胞為105/孔），腫瘤組織中淋巴細胞與單核細胞的比例在文獻中未見報道，我們觀察30份惡性腫瘤的病理切片及慢性髓細胞白血病的骨髓涂片，其比例多數在10∶1至10∶3，少數高達10∶10，因此，在E/T為10∶1的比例孔中按E/Mo細胞為10∶2、10∶5、10∶10比例添加單核細胞，以僅加K562細胞、NK細胞、Mo、NK細胞+Mo、Mo+K562細胞及不加任何細胞的全空白作為對照，混合培養6小時檢測ROM產量，同時在24小時用MTT法［4］檢測K562細胞抑制率(K562 cell inhibition rate，KIR)，計算公式為KIR=（1-ODE/T-DDE/ODT）×100%。每組每種檢測各作3個復孔，觀察ROM產量與KIR、NK細胞數量、Mo數量之間的關系。

　　GSH作用的測定

　　以二氫氯化物組胺為陽性對照，以K562+NK+Mo+IL-2為空白對照，檢測GSH逆轉ROM及提高K562細胞抑制率的作用。按上述細胞比例先分別入NK細胞、單核細胞、IL-2（150 U/ml） (方法根據文獻[5］ )，同時在各個比例孔中分別加組胺（10、20和50 umol/L 3種濃度），GSH（25、50、100和250 μmol/L 4種濃度），在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下共培養24小時后加入K562細胞（按E/T比為10/1），再培養6小時及24小時，檢測ROM產量，同時用MTT法檢測K562細胞抑制率，KIR=（1-ODE/T-ODE/ODT）×100%；同樣每組每種檢測各做3個復孔［4］。

　　ROM檢測

　　采用紫外分光光度比色法、按南京建成活性氧測試盒說明操作，檢測活性氧的產量。

　　K562細胞抑制率 采用MTT法檢測（公式見上）。

　　統計學分析

　　采用SPSS 11.0統計軟件進行統計分析。計量資料結果以x±SD表示，多組均數比較采用廣義線性模型（general linear model），各實驗組均數間多重比較采用LSD-t檢驗（方差齊）或Dunnett T3檢驗（方差不齊時），雙變量相關分析采用Pearson相關分析。以P<0.05 作為差異顯著性檢驗水平。

　　結 果

　　GSH對ROM產量及NK細胞抑制K562的影響

　　當E/Mo=10/2時，各種濃度GSH和組胺均可明顯降低ROM產量，提高K562細胞抑制率（P<0.05），逆轉ROM作用GSH強于組胺；當E/Mo=10/5時，各濃度組胺和高濃度GSH可減少ROM產量（P<0.05），但不能提高K562細胞抑制率；當E/Mo=10/10，僅高濃度的組胺和高濃度GSH可減少ROM產量（P<0.05），各種濃度的組胺和GSH均不能提高K562細胞抑制率（P>0.05）（ 

    NK細胞、Mo、IL-2對ROM產量和K562細胞抑制率的影響

　　結果顯示：K562細胞加入NK細胞后，ROM產量減少（P<0.05），K562細胞抑制率達65.50%，而加入Mo后ROM產量明顯增加，且Mo濃度越高，ROM產量越多，呈量效關系（P<0.05），但K562細胞不被抑制（P>0.05）；加入激活劑IL-2后，K562細胞+NK細胞混合培養體系中ROM產量明顯增多（P<0.05），K562細胞的抑制率明顯提高（P<0.05）；

　　在K562+NK+IL-2培養體系中加入Mo，ROM產量增多，且Mo濃度越高，ROM產量越多，E/Mo=10/1或E/Mo=10/5，K562細胞抑制率改變不明顯，當E/Mo=10/10時，K562細胞抑制率從86.5%降至48.09%（P<0.01）（表2） 。Table 2. Effect of NK cells and/or monocytes on ROM yield and K562 cell inhibiton rate（略）

　　ROM產量與K562細胞抑制的關系

　　ROM的產量與K562細胞的抑制率呈負相關（r=-0.56，P<0.05），ROM產量越高、K562細胞的抑制率越低。隨著Mo濃度的升高，ROM的產量增多，K562細胞的抑制率逐降低，且呈量效關系（P<0.05）。 

    近年來研究發現，腫瘤/白血病細胞內GSH/GST-S活性增高使腫瘤/白血病細胞產生多藥耐藥性［10，11］，細胞內的GSH增多，降低了化療效果。GSH是腫瘤/白血病多源耐藥的機制之一，我們得出了與文獻報道相反的結果的原因是：文獻報道GSH影響腫瘤/白血病療效指的是化療療效，因為許多化療藥物進入細胞內主要通過產生ROM而發揮作用，在ROM作用下線粒體還原型巰基轉化為氧化型二硫鍵，使線粒體通透性轉換孔（mtPTP）開放，并進一步誘導細胞凋亡［12］。因此，腫瘤/白血病細胞內GSH增多，化療藥效降低；而在過繼性免疫治療中，GSH在腫瘤/白血病細胞外起到逆轉Mo產生的ROM，保護T/NK細胞免受ROM的損傷，充分發揮T/NK細胞的抗腫瘤作用。

    綜上所述，GSH具有逆轉ROM，提高NK對腫瘤/白血病細胞的抑制活性，毒副作用輕微，可能成為繼組胺之后更理想抗腫瘤/白血病免疫佐劑，值得進一步研究。

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