鴉膽子油對肝癌細胞SMMC一7721增殖的抑制作用

    目的：探討鴉膽子油抑制肝癌細胞生長的機制。

    方法：人肝癌細胞SMMC一7721培養于含10％胎牛血清、100 U-ml 青霉素、鏈霉素的RPMI1640培養液中。以不同濃度的鴉膽子油乳加入培養液，作用一定的時間，進行M1Tr比色實驗，檢測生長抑制率及分析細胞周期。

    結果：MTT比色法測定顯示鴉膽子油抑制肝癌細胞的生長，隨著濃度增加和作用時間的延長，抑制作用呈現逐漸增加的趨勢。細胞周期分析提示：Gn-G 期比例逐漸增加，而s期比例逐漸減少，1 g•ml 組中各時間點及21xg•ml 組中各時間點均有顯著差異(P<0．01)。G 一M期細胞比例減少，但差異無統計學意義(P>0．05)。

    結論：鴉膽子油抑制體外培養的人肝癌細胞的增殖，機制可能是將肝癌細胞阻滯于Go—G 期。

    肝癌是侵犯青壯年的主要惡性腫瘤之一，發病率及死亡率高。由于大多數肝癌都伴有功能性和器質性改變如肝硬化，肝炎，肝功能損害，其并發癥往往是肝癌患者的主要死亡原因之一。因此導致了手術治療及經肝動脈化療栓塞治療方法在一定程度上受到限制。鴉膽子油對許多腫瘤的生長有一定的抑制作用而無明顯的肝功能損傷Et-23。臨床應用亦證實在原發和轉移性腫瘤的治療中，鴉膽子油也顯示出較好的療效，但鴉膽子在肝癌治療中尚缺乏系統的基礎研究。本實驗通過對人肝癌細胞系的體外培養，研究鴉膽子油對細胞增殖的影響，探討鴉膽子油在治療肝癌中的作用機理。

    1 材料和方法

    1．1 材料

    1．1．1 細胞株人肝癌細胞SMMC一7721，購自中科院藥物研究所。

    1．1．2 主要試劑RPMI一1640培養液、二甲基亞砜(DM．SO)(美國GIBCO公司)、PBS緩沖液，RNA酶，碘化丙啶。鴉膽子油靜脈乳劑(0．1mg／ml，沈陽藥科大學制藥廠)，MTr(美國Sigma公司)，小牛血清(杭州四季青生物材料研究所)。

    1．1．3 主要儀器二氧化碳孵箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、酶標儀、96孔板、全自動化學發光儀。FACSCalibur型流式細胞分析儀。

    1．2 方法

    1．2．1 細胞培養SMMC一7721用1640培養液在37℃ 、5％ CO 及飽和濕度的條件下培養，實驗時取對數生長期細胞。

    1．2．2 細胞周期同步化收集處于對數生長期的細胞，制成單細胞懸液，接種后過夜，棄原培養液，用無Ca ／Mg 的PBS液洗3次，接種于不含血清的培養液，使其處于血清饑餓狀態，24小時后絕大多數細胞處于G。／G 期，便達到細胞周期同步化。

    1．2．3 MTT檢測將1×10 ／ml細胞接種于96孔板，經藥物處理并培養一定時間后，每孔加入2．5mg／ml MTI"試劑201xl，孵育4h，加入200p,1 DMSO，放震蕩器震蕩15min，使沉淀盼結晶充分溶解，用酶標儀(測定波長490nm，參考波長570nm )測定每孔OD值，按下列公式計算抑制率：抑制率=(1一實驗組平均OD值／對照組平均OD值)×100％ [3 ]。

    1．2．4 細胞計數細胞懸液加2％臺盼藍染液混勻后，用細胞計數板計數話細胞。

    1．2．5 流式細胞儀測定細胞周期時相分布及細胞凋亡鴉膽子油乳劑以不同濃度分別孵育SMMC一7721不同時間，并以質量分數10％ RPMI1640細胞培養液替代鴉膽子油乳作陰性對照，按時收集不同質量濃度處理的SMMC一7721，胰酶消化，制成單細胞懸液，PBS洗滌后，離心，加入一20℃ 預冷的無水乙醇固定30min，離心除去乙醇，PBS洗滌，加入碘化丙啶溶液400p,l，4℃作用20min后，進行FACSCalibur流式細胞儀檢測，資料均經Lysis軟件收集和分析。

    1．3 統計學分析

    采用spss 8．0軟件包進行數據分析。

    2 結果

    2．1 鴉膽子油對人肝癌細胞株SMMC一7721增殖的影響低濃度(0．0625 g•ml )的鴉膽子油對人肝癌細胞株SMMC一7721就有抑制作用，隨著鴉膽子油濃度的增加，其抑制作用明顯增強，當鴉膽子油濃度為2 g•rnl 時，作用12小時抑制率可達到63．98％ ，作用36小時抑制率可達到94．46％。鴉膽子油的抑制作用呈量效依賴關系及時間依賴關系。

    2．2 鴉膽子油對人SMMC一7721細胞周期分布的影響

    對照組孵育不同時間Go—G，，S及G 一M期細胞比例無顯著差異(P>0．05)。鴉膽子油乳在同一濃度條件下，隨著藥物作用時間延長，Go—G 期比例逐漸增加，而s期比例逐漸減少，1txg•ml。。組各時間點比較及2 g•ml 組各時間點比較均有顯著差異(P<0．O1)。G-M期比例亦逐漸減少，但差異無統計學意義(P>0．05)。在同一時間點，隨著藥物濃度增加，細胞周期的變化亦呈現上述趨勢。表明鴉膽子乳劑主要使SMMC一7721阻滯在Go —G。。而且，在鴉膽子油乳2 g•ml 濃度和1 g•ml 濃度作用下，流式細胞儀DNA直方圖未出現典型的亞二倍體的凋亡峰，提示鴉膽子抑制SMMC一7721腫瘤細胞生長并不是通過誘導細胞凋亡實現的。

    3 討論

    鴉膽子為苦木科植物鴉膽子的成熟果實，鴉膽子油是鴉膽子果實用石油醚提取所得的脂肪，以大豆磷脂為乳化劑，制成的油水型靜脈注射用乳劑，曾經用于治療阿米巴痢疾等疾病。基礎研究表明：鴉膽子油的主要成分可分為水溶性和脂溶性兩部分，水溶性成分主要是四環三萜類化合物。脂溶性的成分無毒，其中油酸，亞油酸被認為是抗腫瘤的活性成分。鴉膽子油乳為細胞周期非特異性抗腫瘤藥，對多種腫瘤細胞如大腸癌，胃癌，膀胱癌，宮頸癌，卵巢癌，白血病等各期均有殺傷和抑制作用，能明顯抑制腫瘤細胞的合成，與化療及放療合用有增效減毒作用。其可能的作用機制包括直接損傷膜結構，阻滯細胞周期，特異性抑制拓撲異構酶的活力，對多種藥物的耐藥有逆轉作用，通過調節機體免疫等作用殺傷腫瘤，及降低MMP、誘導細胞色素c釋放，誘導腫瘤細胞發生壞死與凋亡等 ，對于某些腫瘤細胞，其抑制作用超過化療藥物 J。鴉膽子中不飽和脂肪酸，特別是油酸、亞油酸，能抑制癌細胞對氧的攝取，導致細胞死亡。同時脂肪酸具有的表面活性對癌細胞有毒性作用，可通過影響線粒體的通透性變化，細胞色素c的釋放，影響磷酸酪氨酸酶等機制，而可導致細胞膜的破裂及細胞死亡 。

    本研究結果顯示：鴉膽子油乳在體外能夠明顯抑制SMMC一7721的增殖。M1Tr結果表明，鴉膽子油乳劑對細胞增殖的抑制隨其質濃度的增高和作用時間的延長而增強。細胞周期實驗證明鴉膽子油乳劑具有阻滯SMMC一7721增殖周期的作用，且SMMC一7721的細胞周期改變為G0-G。期細胞的增加和S期細胞的減少，與對照組相比差異顯著(P<0．O1)，并且這種G0一G。期阻滯作用隨藥物作用時間延長和濃度的增高而增強。

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