復(fù)方鱉甲軟肝方防治肺纖維化細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究

    特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化以肺泡上皮細(xì)胞凋亡（apoptosis）導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)完整性破壞和肺成纖維細(xì)胞增生為特征。早期各種炎癥細(xì)胞和肺泡細(xì)胞分泌炎癥因子引起細(xì)胞損傷與細(xì)胞增殖失控，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的途徑，引起肺纖維化。Bcl-2和Bax是一對相互拮抗的基因產(chǎn)物，兩者自可形成同二聚體，也可相互作用為異二聚體。Bcl-2和Bax與凋亡調(diào)控直接相關(guān)：Bax增高促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bcl-2增高抑制細(xì)胞凋亡。兩者的平衡狀態(tài)維持肺組織細(xì)胞的正常，保持呼吸功能的穩(wěn)定。

　　1 器材

　　1.1 藥物防治藥物：復(fù)方鱉甲軟肝方(內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司生產(chǎn)的復(fù)方中藥干粉，600 g/瓶，批號：20020501)，高劑量1.4 g·kg-1·d-1、中劑量0.7 g·kg-1·d-1、低劑量藥物為0.35 g·kg-1·d-1，相當(dāng)于臨床日用量（0.1 g·kg-1）的14倍，7倍，3.5倍。

　　陽性對照藥：醋酸強(qiáng)的松0.56 mg·100 g-1·d-1，廣東華南制藥廠生產(chǎn)，批號011201。

　　造模藥物：注射用鹽酸博萊霉素(bleomycin，BLM-A5 )，日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)，批號X12100。

　　1.2 動(dòng)物及分組SD大鼠180只，雄性，體重200～220 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物級別：SPF/VAF，許可證編號：SCXK2002-0003。飼養(yǎng)于同級動(dòng)物房，自由飲水。購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。動(dòng)物隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組；模型組；陽性藥物對照組；復(fù)方鱉甲軟肝方（以下表格中簡稱鱉甲方組）高、中、低劑量組。每組30只。各組均于7，14，28 d隨機(jī)抽取10只大鼠采血，同時(shí)取肺制成光、電鏡標(biāo)本。

　　1.3 試劑凋亡試劑購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司分裝的Sigma公司試劑。SP-9002，ZLI-9017DAB，SC-7480 Mouse anti-Bax， SC-1666 Mouse anti-PAR4 SC-7382 Mouse anti-BCL-2。

　　1.4 儀器

　　石蠟切片機(jī)，萊卡2016、包埋機(jī)，KD-BM。低溫冰箱MDFU5410(-60℃)成都泰盟科技有限公司，數(shù)碼顯微照相機(jī)Nikon Coolpi×4500。

　　2 方法

　　2.1 大鼠肺纖維化模型制備用1.5%戊巴比妥鈉（0.1 ml·kg-1）腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部剪去毛、常規(guī)碘酒與酒精消毒，切開頸正中皮膚，逐層分離，暴露氣管，然后用一次性1 ml注射器向氣管內(nèi)注入0.3 ml博萊霉素生理鹽水溶液（5 ml·kg-1），然后立即將動(dòng)物直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)均勻分布。假手術(shù)組大鼠肺部注入等體積的生理鹽水。

　　2.2 取材和切片制備

　　2.2.1 各組光鏡取材常規(guī)取材。事先用APES處理切片，37℃ 24～48 h溫箱干燥備用。石蠟切片，厚度為5 μm。脫蠟后組織片裱于APES處理后的載玻片上（免疫組化染色），入37℃溫箱干燥48 h備用。

　　2.2.2 各組電鏡取材常規(guī)普通電鏡取材。

　　2.3 免疫組化操作步驟（Bcl-2，Bax）將切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ各脫蠟15 min→100%酒精Ⅰ15 min，100%酒精Ⅱ15 min，95%酒精10 min→90%酒精10 min，80%酒精5 min，70%酒精5 min，蒸餾水沖洗→0.3%甲醇-過氧化氫室溫下孵育20 min→蒸餾水洗兩次，2 min/次 ，PBS洗5 min→0.1mol/L枸櫞酸緩沖液內(nèi)微波爐抗原修復(fù)（溫度98～100℃）20 min→室溫自然冷卻后加10%山羊血清，37℃濕盒內(nèi)室溫孵育30 min→傾去血清，不洗，加一抗，鼠抗PARP(1∶100),鼠抗Bax和Bcl-2（1∶100），濕盒內(nèi)4℃過夜。取出濕盒室溫放置30 min，37℃放置1 h→0.01 mol/L PBS洗3次，5 min/次→濕盒內(nèi)滴加生物素化二抗（抗鼠1∶100）→0.01mol/L PBS洗3次，5 min/次→滴加辣根酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，濕盒內(nèi)37℃孵育30 min→0.01 mol/L PBS洗3次，5 min/次→DAB顯色（1 ml蒸餾水中加入DAB、緩沖液及H2O2各一滴，混勻），顯微鏡下控制顯色程度→水充分沖洗以中止顯色→梯度酒精脫水：70%酒精30Sec，80%酒精1 min，90%酒精5 min，95%酒精10 min，100%酒精Ⅰ、Ⅱ各30 min，二甲苯各透明20 min→中性塑膠封固→陰性對照用0.01 mol/L PBS 代替一抗，其余步驟同上。

　　2.4 結(jié)果

　　判定在用DAB顯色的免疫細(xì)胞化學(xué)切片上，陽性反應(yīng)按顏色深淺分為：棕黃色為強(qiáng)陽性；黃色為陽性；淺黃色為弱陽性；與間質(zhì)顏色一致者為陰性。

    3 結(jié)果

　　3.1 電鏡下細(xì)胞凋亡結(jié)果電鏡下可見Ⅱ型細(xì)胞核膜表面凹凸不平，染色體邊集，電子密度增強(qiáng)，固縮現(xiàn)象明顯。胞質(zhì)內(nèi)凋亡小體中可見膜包裹完整的細(xì)胞核碎片。Ⅰ型細(xì)胞細(xì)胞器和胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞膜破壞，核染色質(zhì)的凝集邊界不清。

　　3.2 Bax和Bcl-2在肺組織中表達(dá)免疫組化結(jié)果

　　3.2.1 Bcl-2在肺組織中免疫組化結(jié)果7 d時(shí)Bcl-2在假手術(shù)組肺組織中細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中均無表達(dá)，只在肺間隔Ⅱ型細(xì)胞的核膜部分表達(dá)；復(fù)方鱉甲軟肝方高、中、低劑量組在肺泡上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞部分細(xì)胞質(zhì)呈淺黃染色，呈現(xiàn)陽性表達(dá)，偶見肺巨噬細(xì)胞核著色（棕色）呈強(qiáng)陽性表達(dá)。假手術(shù)組在28 d時(shí)仍然呈肺間隔Ⅱ型細(xì)胞的核膜部分表達(dá)，其意義有待進(jìn)一步探討。模型組肺泡間隔細(xì)胞及巨嗜細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見分布均勻的棕色顆粒，明顯多于假手術(shù)組和藥物組。且絕大多數(shù)已進(jìn)入胞核，而復(fù)方組的Bcl-2的陽性表達(dá)則偏重于胞質(zhì)。

　　3.2.2 Bax在肺組織中免疫組化結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bax在肺組織中主要在肺泡Ⅰ型、部分Ⅱ型細(xì)胞和肺泡腔炎癥細(xì)胞的胞質(zhì)部位呈陽性表達(dá)，部分在肺泡隔間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。7 d時(shí)假手術(shù)組和高、中劑量藥物組在肺泡Ⅰ型和Ⅱ型細(xì)胞、肺泡炎癥細(xì)胞和部分間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中呈陽性表達(dá)，尤其Ⅰ型細(xì)胞中表達(dá)較多，部分間質(zhì)細(xì)胞的胞核也有表達(dá)。在模型組、陽性藥物組、低劑量組在肺間隔肺泡Ⅰ型細(xì)胞有部分表達(dá)，在巨噬細(xì)胞胞漿呈陽性表達(dá)結(jié)果。14 d假手術(shù)組和高、中、低劑量組在肺泡間隔細(xì)胞質(zhì)均呈現(xiàn)弱陽性表達(dá)。陽性藥物組和模型組表達(dá)較弱。28 d假手術(shù)組和高、中、低劑量組肺泡間隔表達(dá)較好，呈陽性，但不如7 d表達(dá)明顯。肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞也有部分表達(dá)。

　　4 討論

    復(fù)方鱉甲軟肝方通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中Bax和Bcl-2的凋亡蛋白表達(dá)，抑制成纖維細(xì)胞增生，抑制細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)AT-II的凋亡，保持上皮細(xì)胞完整性，從而達(dá)到抗纖維化的作用。

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