替莫唑胺緩釋微球局部植入治療大鼠腦膠質瘤的療效

    目的：研究替莫唑胺緩釋微球（TM—MS)局部植入對大鼠C6膠質瘤的治療效果。

    方法：將C6大鼠膠質瘤細胞接種于鼠腦左側尾狀核，制備大鼠腦膠質瘤模型。分別用替莫唑胺口服及TM—MS腫瘤局部植入治療，觀察大鼠的一般情況、生存期、腫瘤體積大小、病理學變化；免疫組織化學染色檢測膠質瘤組織中增殖細胞核抗原蛋白的表達；TUNEL法檢測膠質瘤組織細胞的凋亡。

    結果：TM—MS治療大鼠的生存期較假手術組、空載體組、替莫唑胺口服組明顯延長[(31．2±6．21)d vs(20．7±4．83)、(19．2 4-6．23)、(24．7±6．31)d；P<0．05或P<O．01]。MR／檢查顯示經TM—MS治療后腦內瘤灶體積較假手術組、空載體組、替莫唑胺口服組明顯縮小[(28．8±6．41)mm vs(56．4 4-6．92)、(58．2 4-5．36)、(46．7 4-7．28)mm ；P<0．05或P<0．01]；TM—MS治療后腫瘤細胞PCNA表達率較假手術組、空載體組、替莫唑胺口服組顯著降低[(20．2 4-4．33)％ us(63．2 4-5．91)％ 、(62．1±7．88)％、(41．7±6．71)％；P<n 01]，細胞凋亡率也明顯增高[(32．31 4-3．17)％ 伽(8．63 4-1．52)％、(9．25-+2．31)％ 、(16．14 4-3．42)％；P<0．01]。

    結論：TM．MS局部植入治療大鼠腦膠質瘤能顯著抑制腦膠質瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、延長大鼠生存期，具有潛在的臨床應用價值。

    惡性膠質瘤是中樞神經系統腫瘤中較為常見的一種腫瘤，呈局部浸潤性生長，侵襲性強，富血運，容易復發，預后較差。目前惡性膠質瘤患者中位生存期仍短于1年。化療在惡性膠質瘤的治療中起到輔助治療作用，但容易出現了耐藥現象。腦瘤局部緩釋藥物間質化療有如下優勢：(1)緩釋制劑直接作用于腫瘤部位，避開了血腦屏障，增加了腦瘤化療藥物選擇范圍；(2)能提高局部藥物濃度，減少全身毒性作用；(3)膠質瘤常為局部復發，其90％ 均在原發腫瘤切除部位外圍的2 cm范圍內，這就使其非常適合進行局部緩釋化療。

    替莫唑胺(temozolomide，TM)是一種咪唑四嗪類藥物，較易透過血腦屏障到達腦組織，是目前較好的治療腦膠質瘤藥物。但是目前臨床應用只有口服劑型。第二軍醫大學藥學院以乳酸一羥基乙酸共聚物[poly(1actide-CO-glycolide)，PLGA]為載體，制備了可供腦部植入用的替莫唑胺緩釋微球（TM—MS)制劑，體外實驗顯示該緩釋微球能緩慢釋放12 h，與單純替莫唑胺相比，替莫唑胺緩釋微球有更強的細胞毒性 。本研究以TM-MS局部植入治療大鼠惡性膠質瘤，希望能獲得較好的療效。

    1 材料與方法

    1．1 材料

    C6鼠膠質瘤細胞系由中國科學院上海細胞所提供。替莫唑胺原藥購自北京萊瑞森醫藥科技有限公司，替莫唑胺緩釋微球由第二軍醫大學藥學院藥劑教研室研制和提供。細胞培養液購自杭州四季青生物工程材料有限公司，小牛血清購自美國Gibco公司。PCNA兔抗鼠單克隆抗體購自美國Chemicon公司，原位細胞凋亡檢測試劑盒購自德國Roche公司，ABC免疫組化試劑盒及抗體購自美國SantaCruz公司。主要儀器：江灣Ⅱ型腦立體定向儀購自第二軍醫大學，磁共振儀購自德國Siemens公司。雄性SD大鼠，體重200～300 g，共80只，由第二軍醫大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK(滬)2007-0003。

    1．2 SD大鼠C6腦膠質瘤模型的建立

    C6膠質瘤細胞以含10％小牛血清的DMEM液培養。根據Barker法確定切口和鉆孔位置，在大鼠腦立體定位儀上選取大鼠腦左側尾狀核區為靶點，其坐標為：前囟中點后1．0 mm，矢狀縫右旁開3．5 mm，硬膜下5．0 mm。立體定向植入對數期生長C6腫瘤細胞2×10。個。術后5 d內每只大鼠每天給予青霉素10萬U腹腔注射。術后第5天行頭顱MRI增強掃描，證明大鼠顱內腫瘤生長，確證模型建立成功。該模型在接種后3 d有腫瘤形成，5 d后腫瘤直徑約為3 mm，并進入腫瘤細胞增殖指數期，治療時機以5～14 d為宜 。

    1．3 動物分組與治療

    接種c6膠質瘤細胞后觀察大鼠活動，6 d后將80只SD大鼠隨機分為4組，每組20只。分組具體如下：(1)假手術組，切除腫瘤組織表面腦組織(直徑約3 mm)。(2)空載體植入組，切除腫瘤組織表面腦組織(直徑約3 ITIB3)后，植入空白緩釋微球16 n1g。(3)口服替莫唑胺(TM)組：切除腫瘤組織表面腦組織(直徑約3 mm)，口服替莫唑胺50 mg／kg，連服5 d。(4)替莫唑胺微球(TM-MS)植入組，切除腫瘤組織表面腦組織(直徑約3 mm)后，植入替莫唑胺緩釋微球16 mg(含替莫唑胺1 mg)。分組后各組進行相應治療，治療14 d后參照文獻[16]方法，行冠狀面和矢狀面T1WI平掃及增強掃描，掃描后各組處死10只，剩余10只用于觀察生存期。

    1．4 MRI成像及檢測方法

    在各組治療14 d時行冠狀面和矢狀面T1WI平掃及增強掃描。腫瘤體積計算：根據強化影像在冠狀掃描最大腫瘤平面測量腫瘤最大長徑( )及寬徑( )，在矢狀掃描最大腫瘤平面測量高徑(H)，代入公式：V=(4／3×仃×L×W×日)×1／8。

    1．5 C6膠質瘤的病理學觀察

    各組動物在處死時行標本灌注，甲醛溶液固定16～24 h后進行石蠟包埋，隨后對各組腫瘤組織蠟塊行層厚8 m切片，梯度酒精脫蠟至水，H．E染色，光鏡下病理觀察腫瘤組織。

    1．6 免疫組織化學染色檢測C6膠質瘤組織中增殖細胞核抗原蛋白的表達

    腫瘤石蠟切片脫蠟后，均經0．1 mol／L PBS沖洗2～3 h，3％ H O2滅活內源性過氧化物酶10 min，正常山羊血清封閉25 min，晾干不洗。加入增殖細胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)單抗，37℃1 h過夜。用鏈霉親和素-生物素一過氧化氫酶復合物法(streptavidin—biotin complex，SABC)顯色，根據組織切片顯色情況確定終止時問，一般為5 ～ 10 m i n 。同時作陰性對照實驗。在高倍(4 0 0 倍) 視野下分別計數P C N A陽性細胞數和總細胞數，計算P C N A 陽性率。P C N A 陽性率( ％ ) = 陽性細胞數／總細胞數× 10 0 ％ 。

    1．7 T U N E L 法檢測鼠C 6 膠質瘤細胞的凋亡

按照試劑盒說明步驟操作。石蠟切片常規脫蠟脫水， 蛋白酶K 消化、T U N E L 反應混合溶液標記，D A B 底物反應， 蘇木精復染，脫水、透明、封片。顯微鏡下分析結果：隨機選取5 個高倍鏡視野( > 1000個細胞) ，在光鏡下分別計數凋亡細胞數和總細胞數，凋亡率( ％ ) = 凋亡細胞數／總細胞數X 100 ％ 。

    1．8  統計學處理

    實驗數據均以x ± S 表示， 采用S A S 9．1．3 統計分析軟件進行K a p l a n ． M e i e r 生存分析及方差分析。P < 0 ． 0 5 為差異具有統計學意義。

    2 結果

    2．1 T M — M S 治療腦膠質瘤大鼠的一般療效

    假手術組和空載體組大鼠活動量明顯減少， 食物和水的消耗量降低，皮毛失去光澤， 有不同程度的腹瀉；接種2 周時大多出現明顯的顱內高壓癥狀，表現為偏癱，眼周淤血；接種后第3 周時開始發生死亡， 至第4 周時全部死亡。假手術組和空載體組大鼠平均生存期分別為( 2 0 ． 4 ± 4 ． 8 3 ) d 和( 1 9 ． 6 ±6 ． 2 3 ) d ；給藥T M 后大鼠生存狀態稍有改善，皮毛枯燥， 較萎靡，接種后1 7 d 時開始發生死亡， 至第3 6天時全部死亡， 平均生存期為( 2 4 ． 5 ± 6 ． 3 0 ) d ；給藥T M ． M S 后大鼠生存狀態明顯改善， 皮毛較光鮮， 僅有輕度萎靡， 平均生存期為( 3 0 ． 8 ± 6 ． 2 1 ) d 。4 組大鼠的生存曲線如圖1 ， 分析顯示：T M — M S 治療大鼠的生存期較其他各組顯著延長( P < 0 ． 0 5 ) 。

    2．2 T M—M S 對大鼠腦膠質瘤生長的影響

   荷瘤大鼠組頭顱M R I 平掃+ 增強提示：顱內基底節區類圓形占位， 長T 1 長T 2 均明顯強化， 腦室受壓， 中線結構有移位。假手術組和空載體組腫瘤體積分別為( 5 6．4 ± 6．9 2 )mm3。和( 5 8．2 ± 5．3 6 ) mm3。兩者之間無明顯差異( P >0 ．0 5 ) 。經T M 治療后腫瘤體積有所縮小， 為( 4 6．7± 7．2 8 ) mm3，與假手術組之問有明顯差異( P < 0 ． 0 5 ) 。經T M—M S 治療后腫瘤體積顯著縮小，為( 3 1．2 ± 6．2 1 ) mm3，與假手術組之間有明顯差異( P < 0 ．0 5 ) ，與T M 治療組相比， 也有顯著差異( P < 0 ．0 5 ) 。4 組大鼠腫瘤體積之間有差異(方差分析：F = 3 4 ．3 8 5 1 ，JP = 0 ．0 0 3 2 ) 。

    2．3 大鼠腦膠質瘤組織的病理變化

    光鏡下H—E 染色觀察各只大鼠均可見到膠質瘤，細胞呈假柵欄狀或珊瑚狀排列， 密集成群，并向正常腦組織浸潤生長。腦組織與腫瘤交界處可見腫瘤細胞侵入腦實質，邊界較模糊。經T M 或T M—M S治療后瘤組織中常可見到壞死和囊變灶。

    2．4 T M—M S 對腦膠質瘤組織P C N A 表達的抑制采用P C N A 表達陽性率作為腫瘤細胞增殖活性測定的指標，P C N A 陽性細胞的胞核或( 和) 胞質中出現了棕黃色顆粒。假手術組和空載體組腫瘤P C N A 表達陽性率分別為( 6 3 ．2 ±5 ．9 ) ％ 和( 6 2 ．1 ± 7．8 )％ ，兩者之間無明顯差異( P> 0．0 5 ) 。經T M 治療后，腫瘤P C N A 表達陽性率有所減少，為( 4 1 ． 7 ± 6 ． 7 ) ％ ， 與假手術組之間有明顯差異( P < 0．0 1 ) 。經T M — M S 治療后， 腫瘤P C N A 表達陽性率顯著減少， 為( 2 0．2 ± 4．3 ) ％ ，與假手術組之間有明顯差異( P < 0 ． 0 1 ) ， 與T M 治療組相比也有顯著差異( P < 0 ． 0 5 ) 。

    2．5 T M—M S 誘導膠質瘤細胞凋亡

    T U N E L 法檢測結果顯示，假手術治療大鼠膠質瘤組織中可見少量細胞核呈棕黃染色， 為凋亡細胞，細胞凋亡率為( 8 ． 6 3 ± 1 ． 5 2 ) ％ ；空載體治療大鼠膠質瘤的細胞凋亡率為( 9 ． 2 5 ± 2 ． 3 1 ) ％ ；T M 治療大鼠膠質瘤出現稍多的凋亡細胞，細胞凋亡率為( 1 6．14 ± 3．4 2 ) ％ ；T M—M S 治療大鼠膠質瘤細胞凋亡率為( 3 2．3 1 ± 3．1 7 ) ％ ，凋亡率最高。三者問的差異有統計學意義( 方差分析：F = 9 4 ．0 5 4 3 ，P = 0．0 0 1 2 ) 。結果說明T M—M S 能顯著誘導膠質瘤細胞凋亡。

    3  討論

    惡性膠質瘤手術切除后復發率高，預后差。目前對膠質瘤的治療仍主張采用包括手術、放療、化療和免疫治療等在內的綜合治療。藥物治療和治療手段的改進是目前研究的重要方向之一。傳統的全身藥物有以下的局限性：( 1 ) 多數的化療藥物為水溶性，相對分子質量較大， 難以透過血腦屏障；( 2 ) 以卡氮芥( B C N U ) 為代表的亞硝基脲類藥物為脂溶性制劑， 雖能透過血腦屏障但全身用藥引起相當大的毒性作用；( 3 ) 半衰期短，在腦內難以維持穩定的有效濃度。

    近十年來，藥物“ 緩釋劑型”“瘤內給藥” 的方法為膠質瘤的治療開辟了新途徑。腫瘤內或間質內用藥的優越性在于：( 1 ) 局部給藥，避開了血腦屏障，提高了局部藥物濃度，且藥物的選擇不再受其理化性質的影響；( 2 ) 藥物直接與腫瘤細胞接觸， 全身毒性作用小；( 3 ) 使“ 峰谷現象” 降低到最低程度；治療時間短， 費用少。臨床觀察發現， 9 0 ％ 的惡性膠質瘤通常在腫瘤切除部位外圍的2 c m 內復發， 極少發生中樞神經以外的轉移。這一特點為腫瘤內或間質內用藥提供了治療空間。

    聚乳酸一羥基乙酸共聚物[P L G A]是近年來發展起來的一種由典型的d 一羥基酸聚合而成的一種無毒、無刺激性的完全生物降解性材料。由于其良好的生物相容性及生物降解性已被美國F D A 批準為藥用高分子材料使用。研究證實， P L G A 在腦組織中也具有很好的生物相容性和生物降解性爭如。本研究將P L G A 為載體，研究制備了可供腦部植人用的替莫唑胺緩釋微球制劑( T M ． M S ) 治療腦膠質瘤。空載體組生存期與空白組之間無明顯延長， 說明P L G A 對腫瘤的生長并無抑制作用。本研究結果顯示：替莫唑胺口服治療荷瘤大鼠， 其大鼠的生存期明顯長于對照組， 實驗結果與P r a d o s等在一項多中心II 期臨床試驗中證實的T M 能夠明顯延長患者無進展生存期、提高生存率、改善生活質量的報道吻合。腫瘤局部置入替莫唑胺緩釋微球的荷瘤組大鼠， 其生存期明顯長于替莫唑胺口服組， 其原因主要是由于替莫唑胺微球在腫瘤局部緩慢釋放藥物，使腫瘤局部獲得了較高的替莫唑胺藥物濃度；同時替莫唑胺微球緩慢釋放延長了藥物作用時間， 使腫瘤細胞能更長期地受到藥物作用。本研究頭顱M R I 影像學結果也顯示，替莫唑胺微球組的腫瘤體積較替莫唑胺口服組明顯縮小，該結果說明替莫唑胺緩釋微球較替莫唑胺口服制劑更能抑制腫瘤的生長。

    PCNA是一種相對分子質量為36 000的多肽，僅在增殖細胞中合成與表達，被用于研究惡性腫瘤的細胞增殖和判斷其惡性程度，對腫瘤的治療及預后的判斷有重要意義。本研究檢測結果提示，各組間PCNA陽性率有顯著差異，替莫唑胺口服組較對照組為低，說明替莫唑胺通過口服能抑制腫瘤細胞的增殖，替莫唑胺緩釋微球組較替莫唑胺口服組更低，說明替莫唑胺微球在腫瘤局部的緩慢釋放較該藥物口服吸收更能有效地抑制腫瘤細胞的增殖。

    替莫唑胺是一種咪唑四嗪類具有抗腫瘤活性的烷化劑，通過誘導腫瘤細胞發生凋亡是其主要的作用機制。本研究通過TUNEL法研究各組腫瘤細胞凋亡情況，研究結果顯示，替莫唑胺口服組腫瘤細胞凋亡率要明顯高于對照組，而替莫唑胺緩釋微球組腫瘤細胞凋亡率則更高。該結果與替莫唑胺微球較替莫唑胺口服更能抑制腫瘤生長的結果相吻合，考慮主要與替莫唑胺微球能使瘤床局部獲得高藥物濃度和替莫唑胺微球緩慢釋放藥物使藥物能更長時間作用于腫瘤細胞有關。研究結果初步表明，替莫唑胺緩釋微球間質植入治療較替莫唑胺口服能促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、縮小腫瘤體積、延長實驗動物生存時間。替莫唑胺緩釋微球有望成為局部治療膠質瘤的優選藥物。

    [參考文獻]
   

    （略）

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